Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4252
Olma, Sebastian
Radiofluorinated quinoxalinedione derivatives as putative ligands of the AMPA receptor
89 S., 2007
Die Markierung physiologisch relevanter Molekule mit trägerarmem (n.c.a.) [18F]Fluorid erfolgt im
Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieser "Radiotracer" als Diagnostika in der Positronen-Emissions-
Tomographie. Um neue, 18F-markierte Radioliganden mit Harnstoffstruktur für den AMPA-Rezeptor zu
erhalten, wurde in dieser Arbeit zunachst eine Synthese von 4-[18F]Fluorphenylharnstoffen entwickelt.
Eine direkte Markierung von 4-Fluorphenylharnstoffen uber eine SNAr-Reaktion an diesen
elektronenreichen und daher nukleophil nicht aktivierten Aromaten ist nicht möglich. Deshalb wurden
Radiosynthesen in drei bzw. vier Schritten entwickelt. In den ersten beiden Stufen wurde
4-[18F]Fluoranilin hergestellt, dessen Synthese bereits mehrfach beschrieben wurde. Die vorteilhaften
Aspekte all jener Synthesekonzepte wurden in Bezug auf weitere Optimierung von Ausbeute und
Synthesezeit berücksichtigt. Von para-Dinitrobenzol gelangte man nach Umsetzung mit n.c.a.
[18F]Fluorid, aktiviert durch einen Kalium-Kryptofix-Komplex, in DMSO bei 120 °C nach 3 min zum
4-[18F]Fluornitrobenzol. Die nachfolgende Reduktion der Nitro-Funktion mit Palladium (schwarz) und
Phosphoriger Säure in Methanol unter Rückflussbedingungen erwies sich als beste Methode, um
trägerarmes 4-[18F]Fluoranilin zu erhalten. Die Synthesezeit bis zu diesem Schritt betrug 30 min bei einer
radiochemischen Ausbeute von uber 80%.
Für die Weiterreaktion zu Harnstoffen erwies sich der Weg uber aktivierte Carbamatester geeignet,
nachdem Methoden uber Isocyanate nicht zum Erfolg führten. Nach Umsetzung eines Carbamat-4-
nitrophenylester mit einem Amin erhielt man den entsprechend substituierten Harnstoff. Bei der
Radiosynthese konnte nun alternativ das [18F]Fluoranilin mit Chlorameisensäure-4-nitrophenylester zum
Carbamat und weiter mit einem gewünschten Amin umgesetzt werden, oder es wurde mit einem
Carbamat-4-nitrophenylester eines beliebigen Amins reagieren lassen.
Es zeigte sich, dass der [18F]Fluorphenylcarbamat-nitrophenylester in nahezu quantitativer Ausbeute
erhalten wird. Seine Umsetzung mit n-Propylamin, cyclo-Hexylamin, Benzylamin oder Anilin fuhrte mit
radiochemischen Gesamtausbeuten von uber 70% zu den entsprechenden trägerarmen
[18F]Fluorphenylharnstoffen. Um bei der Radiosynthese Schritte, d. h. Zeit und Aufwand einzusparen,
wurde von denselben vier Aminen auch der jeweilige Carbamat-4-nitrophenylester hergestellt und dieser
dann direkt mit n.c.a. [18F]Fluoranilin zur Reaktion gebracht. Hierbei waren die Ausbeuten beim
Phenylcarbamat, Benzylcarbamat und cyclo-Hexylcarbamat mit 50 bis 70% generell geringer, wahrend
beim n-Propylcarbamat kaum ein Umsatz erkennbar war.
Die Übertragung dieser allgemeinen Radiosynthese von [18F]Fluorphenylharnstoffen auf die Darstellung
zweier potentieller AMPA-Rezeptorliganden aus der Familie der Quinoxalindione (QX) schlug fehl. Schon
die Synthese der stabilen Referenzsubstanzen gelang nicht.
Versuche zur Radiosynthese weniger komplexer Quinoxalindione fuhrten jedoch zum Erfolg. Dinitround
Cyano-nitro-QX sind etablierte Antagonisten des AMPA-Rezeptors. Durch die Nitro- bzw. die Cyano-
Gruppe ist der aromatische Ring für eine SNAr-Reaktion mit [18F]Fluorid aktiviert, wobei eine Nitro-Gruppe
selbst als gute Abgangsgruppe dienen kann. Als Referenzsubstanzen konnten die entsprechenden
Fluoranaloge Fluor-nitro-QX (FNQX) und Fluor-cyano-QX (FCQX) hergestellt werden. Die Radiosynthese
von [18F]FNQX erfolgte mit DNQX als Vorlaufer unter Kryptofix-Aktivierung in DMSO bei 180 °C innerhalb
von 20 min. Die radiochemische Ausbeute mit 5 - 10% bei einer molaren Aktivitat von 1,5 GBq/ μmol war
gering aber ausreichend für erste pharmakologische Untersuchungen. Eine 18F-Markierung von FCQX
gelang nur uber einen 18F-für-19F Austausch mit ebenfalls niedrigen Ausbeuten.
Zur pharmakologischen Evaluierung wurden nicht radioaktives FNQX und FCQX in Kompetitionsstudien
mit tritiiertem AMPA in vitro eingesetzt, um ihre Inhibitionskonstante Ki zu bestimmen. Es zeigt sich, dass
ihre Affinitat zum AMPA-Rezeptor (1,4 μM bzw. 3,9 μM) im Vergleich zu CNQX (0,5 μM) oder AMPA
(0,06 μM) deutlich niedriger war. Die Werte ordnen sich dabei gut in die Struktur-Wirkungs-Beziehung
des allgemeinen Substitutionsschemas der QX ein. In Blockierungsexperimenten an Rattenhirnschnitten
zeigte sich, dass die Bindung von [3H]AMPA oder [18F]FNQX weder durch einen Uberschuss an FNQX
noch an FCQX vollstandig verhindert wird. Dies spricht für einen hohen Anteil unspezifischer Bindung der
Liganden im Hirngewebe. Ex vivo Untersuchungen mit [18F]FNQX an Ratten ergaben, dass die
Hirnaufnahme des Radiotracers extrem gering ist. Diese Ergebnisse schliesen eine Nutzung der
Substanzen als Radiopharmaka für die in vivo Bildgebung aus.
Labeling of physiologically relevant molecules with no carrier added (n.c.a.) [18F]fluoride is performed
with the aim of an application of these "gradiotracers" in positron emission tomography. In order to find 18Flabeled
radioligands of the AMPA receptor on the basis of the urea structure, the first task of this work
was to develop a synthesis of 4-[18F]fluorophenyl urea derivatives.
A direct labeling of the electron rich, i.e. not activated, 4-fluorophenyl ureas by an SNAr-reaction is not
possible. Thus, radiosyntheses involving three or four step procedures were developed.
4-[18F]Fluoroaniline was produced in the first two steps, whose synthesis has already been described
several times in the literature. All those concepts were combined to give an optimum method regarding
efficiency and duration. The reaction of para-dinitrobenzene with n.c.a. [18F]fluoride, activated by the
potassium-Kryptofix-complex, in DMSO at 120 °C leads to 4-[18F]fluoronitrobenzene. For the subsequent
reduction of the nitro-group, palladium (black) and phosphoric acid in methanol under reflux conditions
proved to be the best system to yield 4-[18F]fluoroaniline. The time of synthesis until this step was 30 min
with a radiochemical yield of at least 80%.
Subsequent transformation to the 4-[18F]fluorophenyl ureas was performed via carbamate-4-
nitrophenylesters, whereas strategies involving isocyanate compounds failed. In general, reactions of
carbamate-4-nitrophenylesters with an amine yielded the corresponding urea. Hence, two different ways
for the radiosynthesis are possible. One is to produce the carbamate in a reaction of [18F]fluoroaniline with
4-nitrophenyl chloroformate, followed by addition of an amine of choice. To avoid one radiosynthetic step,
the [18F]fluoroaniline can alternatively be reacted directly with the 4-nitrophenyl carbamate of the amine.
The yields of the [18F]fluorophenylcarbamate-4-nitrophenylester from [18F]fluoroaniline are nearby
quantitative. Subsequent reaction with n-propyl amine, cyclo-hexyl amine, benzyl amine or aniline leads
to the corresponding ureas with an overall radiochemical yield of more than 70%. The shorter
radiosyntheses with [18F]fluoroaniline and phenylcarbamate, benzylcarbamate or cyclo-hexylcarbamate
gave generally a lower RCY in the range of 50 to 70%. With the n-propylcarbamate nearly no conversion
to the urea is detectable.
A direct application of this general method to preparation of n.c.a. [18F]fluorophenyl ureas for the
synthesis of two putative AMPA-receptor ligands of the quinoxalinedione-family (QX) failed. Even the
synthesis of the stable reference substances was not successful. Therefore a change to less complex
quinoxalinediones appeared necessary, and those labeling approaches led to success. Dinitro- and
cyano-nitro-QX are established antagonists of the AMPA-receptor. The aromatic rings in these molecules
are activated by the nitro- or cyano-group, respectively, for the SNAr-reaction with [18F]fluoride, whereas
one nitro-group might function as leaving group. The relevant stable analogues fluoro-nitro-QX (FNQX)
and fluoro-cyano-QX (FCQX) were synthesized as reference substances. The radiosynthesis of
[18F]FNQX was performed with DNQX as precursor and Kryptofix-activation in DMSO at 180 °C and a
reaction time of 20 min. With the low RCY of 5 . 10% and a molar activity of 1.5 GBq/μmol there was
enough labeled product for first pharmacological experiments. 18F-labeling of FCQX was only possible by
an 18F-for-19F isotopic exchange reaction. Therefore, the [18F]FNQX contains carrier, and the RCY with
about 5% is again very low.
For the general evaluation of the affinity of FNQX and FCQX the stable reference substances were
utilized in competition studies with tritiated AMPA in vitro. Their affinities in form of the inhibition constants
Ki were determined with 1.4 μmol and 3.9 μmol, respectively, which are clearly lower than those of CNQX
(0.5 μmol) or AMPA (0.06 μmol). Nevertheless, the general mode of structur-activity-relationship in QXderivatives
could be affirmed by these studies.
Blocking experiments with rat brain slices showed that the binding of [3H]AMPA or [18F]FNQX can be
neither completely blocked by an excess of stable FNQX nor by an excess of stable FCQX. This is an
evidence for a large fraction of unspecific binding of the ligand in brain tissue. Finally, the extremely low
brain uptake of [18F]FNQX, which was determined in ex vivo examinations, led to the conclusion that
these substances are not suited for radiopharmaceutical application of in vivo imaging.
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