Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4250
Dertinger, Thomas
Two-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy
86 S., 2007
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) wurde vor mehr als 30 Jahren
entwickelt und erfuhr durch die Entwicklung von stabilen und einfach handhabbaren
Laserquellen sowie hocheffizienter Einzel-Photonen-Detektoren eine Renaissance. Die
Fähigkeit, Diffusionskoeffizienten auch bei nanomolarer Probenkonzentration messen zu
können, trug maßgeblich zur Verbreitung der FCS auf dem Gebiet der Biophysik bei. Die
vergangenen Jahre haben jedoch gezeigt, dass sowohl optische Abberationen (z.B.
Astigmatismus, Brechungsindex Abweichung) als auch photophysikalische Effekte (wie
z.B. optische Sättigung) das Ergebnis eines FCS-Experimentes maßgeblich beeinflussen
können, so dass eine zuverlässige und genaue Bestimmung des Diffusionskoeffizienten
nicht mehr möglich ist.
In der vorliegenden Arbeit berichten wir über die Entwicklung, Implementation und
Anwendung einer neuartigen und robusten Modifikation herkömmlicher FCS, die wir 2-
Fokus-FCS (2fFCS) nennen und die zwei Voraussetzungen erfüllt: (i) es wird ein externer
Maßstab in die Messung eingeführt, indem zwei lateral versetzte aber überlappende
Laserfoki der gleiche Wellenlänge in einem wohldefinierten Abstand generiert werden. (ii)
Diese Foki und deren korrspondierende Molekül-Detektions-Funktionen (MDF) können
durch ein einfaches zwei-Parameter Modell ausreichend gut beschrieben werden.
Diese beiden Eigenschaften ermöglichen uns, Diffusionskoeffizienten mit höchster
Genauigkeit zu messen. Desweiteren zeigt sich, dass das neue Messprinzip robust ist
gegenüber Brechungsindex-Abweichungen, optischer Sättigung oder Deckglassdicken-
Schwankungen. Diese Arbeit befasst sich hauptsächlich mit der Einführung des neuen
Messprinzips der 2fFCS, jedoch werden auch etliche Anwendungen von weitreichender
Bedeutung vorgestellt.
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) has been invented more than 30 years
ago and experienced a renaissance after stable and affordable laser sources and low-noise
single-photon detectors have become available. Its ability to measure diffusion coefficients
at nanomolar concentrations of analyte made it a widely used tool in biophysics. However,
in recent years it has been shown by many authors that aberrational (e.g. astigmatism) and
photophysical effects (e.g. optical saturation) may influence the result of an FCS
experiment dramatically, so that a precise and reliable estimation of the diffusion
coefficient is no longer possible.
In this thesis, we report on the development, implementation, and application of a new
and robust modification of FCS that we termed two-focus FCS (2fFCS) and which fulfils
two requirements: (i) It introduces an external ruler into the measurement by generating
two overlapping laser foci of precisely known and fixed distance. (ii) These two foci and
corresponding detection regions are generated in such a way that the corresponding
molecule detection functions (MDFs) are sufficiently well described by a simple twoparameter
model yielding accurate diffusion coefficients when applied to 2fFCS data
analysis.
Both these properties enable us to measure absolute values of the diffusion coefficient
with an accuracy of a few percent. Moreover, it will turn out that the new technique is
robust against refractive index mismatch, coverslide thickness deviations, and optical
saturation effects, which so often trouble conventional FCS measurements. This thesis
deals mainly with the introduction of the new measurement scheme, 2fFCS, but also
presents several applications with far-reaching importance.
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