Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4233
Bremus, Christoph
Untersuchungen zur Bildung der Vitamin C-Vorstufe 2-Keto-L-Gulonsäure mit Gluconobacter oxydans
122 S., 2006
Untersuchungen zur Bildung der Vitamin C-Vorstufe 2-Keto-L-Gulonsäure mit
Gluconobacter oxydans
Die mikrobielle Synthese der Vitamin C-Vorstufe 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KGLA) kann mit
G. oxydans durch Sorbitoloxidation über die Intermediate Sorbose und Sorboson erfolgen.
Diese Reaktionen werden von einer membranassoziierten Sorbitol-DH (SLDH), einer
membranassoziierten Sorbose-DH (SDH) und einer zytosolischen Sorboson-DH (cSNDH)
katalysiert. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten
G. oxydans-Stämmen, die mit so hohen für die 2-KGLA-Synthese notwendigen Enzymaktivitäten
ausgestattet sind, um Sorbitol effizient zu 2-KGLA zu oxidieren.
Zur Konstruktion der rekombinanten 2-KGLA-Produktionsstämme wurde G. oxydans
DSM 2343 ausgewählt, da dieser Stamm bei geringer Biomasseproduktion die Oxidation von
Sorbitol zu Sorbose vollständig und mit einer sehr hohen Produktbildungsrate durchführte.
Für die weitere Umsetzung von Sorbose zu 2-KGLA wurde in G. oxydans DSM 2343 neben
den Genen für die SDH und die zytosolische cSNDH auch das Gen einer membrangebundenen
SNDH (mSNDH) aus A. liquefaciens funktionell überexprimiert, so dass die
2-KGLA-Synthese vollständig im Periplasma stattfinden konnte. Nachdem die Expression
der heterologen Gene auf Transkriptions-, Translations- und Enzymaktivitätsebene überprüft
wurde, standen definierte Stämme zur Verfügung, in denen alle zur 2-KGLA-Synthese
benötigten Enzyme mit ausreichender Aktivität vorhanden waren. Die SDH/cSNDHÜberproduzenten
setzen 100 g/l Sorbitol mit einer spezifischen 2-KGLA-Ausbeute von 7 g
2-KGLA/g Zell-Trockenmasse zu 15 g/l 2-KGLA um. Auch mit den SDH/mSNDH-Überproduzenten
konnten bis zu 12 g/l 2-KGLA aus 100 g/l Sorbitol produziert werden.
Um die 2-KGLA-Ausbeuten zu steigern, wurde untersucht über welchen Stoffwechselweg
Sorbose in G. oxydans abgebaut wird. Dabei konnte der Pentosephosphatweg (PPW) als
Hauptstoffwechselweg identifiziert werden. Korrelierend zur Sorboseverwertung und
Biomassebildung wurden in einigen G. oxydans-Stämmen bis zu 60 % der Sorbose im PPW
zu CO2 umgesetzt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Aktivitäten von
Transaldolase und Phosphoglukoseisomerase für die PPW-Stoffwechselleistung und damit
für die Höhe der CO2- und Biomasseproduktion verantwortlich sind. Da in G. oxydans
DSM 2343 beide Aktivitäten sehr gering waren, wurden bei der Sorbitol-Biotransformation
korrelierend zu der geringen Biomasseproduktion nur 10 % des Substrats zu CO2 umgesetzt.
Folglich stehen in G. oxydans DSM 2343 etwa 90 % des Substrats für die 2-KGLA-Bildung
zur Verfügung, während die 2-KGLA-Ausbeute mit anderen untersuchten Stämmen dadurch
begrenzt ist, dass ein Großteil des Substrats im PPW zur Energieerzeugung für den
Biomasseaufbau assimiliert wird. Mit den konstruierten G. oxydans DSM 2343-Stämmen
stehen somit bezüglich des Sorbosemetabolismus und aller an der 2-KGLA-Synthese
beteiligten Enzyme detailliert charakterisierte Stämme zur Verfügung, um die 2-KGLAProduktion
durch gezielte Modifikationen im Sorbosestoffwechsel weiter zu verbessern.
Research regarding the formation of the vitamin C precursor 2-keto-L-gulonic
acid with Gluconobacter oxydans
Microbial synthesis of the vitamin C precursor 2-keto-L-gulonic acid (2-KGLA) can be
achieved with G. oxydans by sorbitol oxidation via the intermediates sorbose and sorbosone.
These reactions are catalysed by a membrane bound sorbitol dehydrogenase (SLDH), a
membrane bound sorbose dehydrogenase (SDH) and a cytosolic sorbosone dehydrogenase
(cSNDH). Aim of this work was the construction and characterisation of recombinant
G. oxydans strains, that were equipped with all 2-KGLA forming enzyme activities to convert
sorbitol efficiently to 2-KGLA.
G. oxydans DSM 2343 was selected to construct recombinant 2-KGLA production
strains, because this strain performs the oxidation of sorbitol to sorbose quantitatively and
with very high product formation rates but produces thereby only low biomass. For the
following conversion steps from sorbose to 2-KGLA the genes encoding the SDH and the
cytosolic cSNDH were introduced into G. oxydans DSM 2343. Additionally the gene of a
membrane bound SNDH (mSNDH) from A. liquefaciens was functional expressed to perform
the 2-KGLA synthesis completely in the periplasm of G. oxydans. The expression of the
heterologous genes on the level of transcription, translation and enzyme activity was
analysed resulting in well defined strains. For production of 2-KGLA these recombinant
strains possessed all essential enzymes at sufficient activities. The SDH/cSNDH
overproducers converted 100 g/l sorbitol to 15 g/l 2-KGLA at a specific 2-KGLA yield of 7 g
2-KGLA/g cell dry weight. With the SDH/mSNDH overproducers up to 12 g/l 2-KGLA could
be produced out of 100 g/l sorbitol.
In order to increase the 2-KGLA yields the sorbose metabolism of G. oxydans was
studied. The pentose phosphate pathway (PPW) was identified as main pathway for sorbose
catabolism. In correlation to sorbose consumption and biomass formation some G. oxydans
strains converted up to 60 % of the supplied sorbose to CO2 within the PPW. Moreover, it
was shown, that the activities of transaldolase and phosphoglucose isomerase were
responsible for the PPW activity and thus for the magnitude of CO2 and biomass production.
In G. oxydans DSM 2343 both activities are very low. Therefore, in sorbitol
biotransformations only 10 % of the substrate was converted to CO2 and low biomass was
produced. Hence in G. oxydans DSM 2343 about 90 % of the supplied substrate was
available for the 2-KGLA formation, whereas the 2-KGLA yields in some other investigated
strains were limited due to the fact, that a large proportion of the substrate was used for
generating energy and reduction equivalents for growth. In conclusion, insight into the
sorbose metabolism and the enzymology of 2-KGLA synthesis is provided so that a further
increase 2-KGLA production may be achieved by directed modification of sorbose
metabolism.
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