Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4231
Georgi, Tobias
Regulation der Zuckerverwertung in Corynebacterium glutamicum
124 S., 2006
In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Zucker Glukose, Fruktose und Saccharose auf das
Wachstum sowie die Lysin- und Glutamatproduktion von C. glutamicum untersucht.
Die Wachstumsraten und Biomasseerträge sowie die durch Ethambutol induzierte
Glutamatproduktion von C. glutamicum Wildtyp wiesen auf Glukose, Fruktose und
Saccharose keine signifikanten Unterschiede auf. Die Lysinausbeute war bei dem Stamm
C. glutamicum DM1730 jedoch auf Glukose mehr als doppelt so hoch wie auf Fruktose,
Saccharose oder Glukose + Fruktose. Die Überexpression des Gens für das Malic enzyme
zur Verbesserung der NADPH-Bereitstellung hatte keinen Einfluss auf die Lysinproduktion
während die Überexpression des Gens für die Fruktose-1,6-Bisphosphatase auf Saccharose
fast zu einer Verdopplung der Lysinausbeute führte. Dabei wurde nur auf Saccharose die
intrazelluläre Konzentration von Fruktose-1,6-Bisphosphat, einem kompetitiven Inhibitor von
Enzymen des Pentosephosphatweges signifikant gesenkt. Dies führte vermutlich zu einem
höheren Kohlenstofffluss über den Pentosephosphatweg und damit zu einer besseren
NADPH-Versorgung. Eine direkte Erhöhung der NADPH-Bereitstellung durch heterologe
Überexpression der Transhydrogenase pntAB aus E. coli führte zu erhöhten Lysinausbeuten
auf allen getesteten Zuckern.
Zur Identifizierung der Glukose-, Fruktose- und Saccharosestimulons wurden DNA-Chip-
Untersuchungen zur globalen Genexpression bei Wachstum von C. glutamicum auf diesen
verschiedenen Zuckern durchgeführt. Diese ergaben, dass auf LB-Medium in Anwesenheit
aller getesteten Zucker die Expression von 53 Genen, die unter anderem für Transporter und
Enzyme zur Aufnahme oder Verwertung alternativer C-Quellen kodieren, reprimiert wurde.
Darüber hinaus wurde in LB-Medium durch Anwesenheit von Fruktose und Saccharose die
Expression von Genen zur Adaption an Stickstoffmangel induziert. Dies war mit einer
reduzierten Expression von Genen für Enzyme zur Oligopeptidverwertung verbunden.
Daraus ging hervor, dass in LB-Medium die Stickstoffverfügbarkeit in Anwesenheit von
Fruktose und Saccharose limitierend war.
Um regulatorische Effekte durch PTS-Zucker auf die Verwertung alternativer Kohlenstoffquellen
zu untersuchen, wurde C. glutamicum auf Substratgemischen, bestehend aus einem
PTS-Zucker und einer organischen Säure, kultiviert und der Verbrauch der Kohlenstoffquellen
bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Glukoseverwertung in C. glutamicum durch
Acetat, Pyruvat und L-Lactat ca. vierfach reduziert wurde, während die Fruktose- und
Saccharoseaufnahme nicht beeinflusst waren. Beim Wachstum auf Fruktose und L-Lactat
zeigte sich ein diauxisches Wachstum unter Bevorzugung von Fruktose.
Zur Aufklärung des Mechanismus der Fruktose/L-Lactat-Diauxie wurde die Regulation der
Gene für die Enzyme der L-Lactatverwertung untersucht. Dabei wurde der bis dahin
unbekannte Regulator NCgl2814 als Repressor des für die L-Lactatverwertung essentiellen
Operons NCgl2816-lldD identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Repressor in der
Region -89 bis -35 bp stromaufwärts vom Translationsstart des NCgl2816-lldD-Operons
bindet und dass die Bindung mit zunehmenden Konzentrationen von L-Lactat ab 10 mM
inhibiert wird. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Modell zur Regulation der zur
L-Lactatverwertung essentiellen Gene erstellt. In diesem Modell bindet NCgl2814 in
Abwesenheit von L-Lactat an den NCgl2816-lldD-Promotor und reprimiert dessen
Expression, während NCgl2814 in Anwesenheit von L-Lactat vom Promotor dissoziiert, was
zur Erhöhung der Expression der Gene für die Enzyme der L-Lactatverwertung führt.
In this work the influence of the PTS-sugars glucose, fructose and sucrose on growth as well
as on lysine- and glutamate production in C. glutamicum was investigated.
Growth rates, biomass yields and ethambutol induced glutamate production showed no
differences on glucose, fructose or sucrose. In contrast, the lysine yield of C. glutamicum
DM1730 on glucose was more than twofold increased as compared to the other tested
sugars. Overexpression of the malic enzyme gene to improve the NADPH supply had no
effect on the lysine yield whereas overexpresion of the fructose-1,6-bisphosphatase (fbp)
gene resulted in a doubling of the lysine yield on sucrose. This result could be explained by
the observation of a decreased intracellular concentration of fructose-1,6-bisphosphate, a
competive inhibitor of the key enzymes of the pentose phopshate pathway, apon
overexpression of fbp. That probably led to a higher carbon flux through the pentose
phosphate pathway and thus to a better NADPH supply. A direct increase of the NADPH
supply by overexpression of the transhydrogenase pntAB from E. coli led to increased lysine
yields on all tested carbon sources.
In order to identify the glucose, fructose and sucrose-stimulons, the global gene expression
patterns during growth on these sugars were investigated using DNA-chips. The data
revealed 53 genes repressed on LB-medium in the presence of any PTS-sugar. Some of
these genes encoded transporters and enzymes for utilization of alternative carbon sources.
Moreover, in the presence of fructose and sucrose the expression of genes necessary for
adaptation to nitrogen starvation was increased. That effect could be explained by a
concomitant repression of genes for utilization of oligopeptides, an important nitrogen source
during growth on LB-medium. Thus, it was concluded that the nitrogen availability was limited
in the presence of fructose and sucrose.
To investigate regulative effects of PTS-sugars on utilization of alternitive carbon sources,
carbon consumption rates were determined during growth of C. glutamicum on subtrate
mixtures, consisting of a PTS-sugar and an organic acid. It was shown that the glucose
consumption rate was inhibited fourfold by acetate, pyruvate and L-lactate while fructose und
sucrose consumption was nat affected by these organic acids. During growth on fructose and
L-lactate a diauxic growth pattern under preference of fructose was observed.
To elucidate the mechanism of the fructose/L-lactate diauxie, the genetic regulation of the
essential genes for L-lactate utilization was scrutinized. The so far unknown regulator
NCgl2814 could be identified as a repressor of the L-lactate utilization operon NCgl2816-
lldD. It could be shown that NCgl2814 binds -89 to -35 bp upstream of the translational start
site of the NCgl2816-lldD operon. Binding of NCgl2814 was inhibited in the presence of
10 mM L-lactate. Based on this results a model for the regulation of the L-lactate metabolism
was established. In this model in the absence of L-lactate NCgl2814 binds to the NCgl2816-
lldD-promoter und represses its expression, while NCgl2814 dissociates from the promoter in
the presence of L-lactate whichs results in an increased expression of the L-lactate utilization
operon.
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