Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4227
Han, Yinhua
Label-free detection of biomolecules by a field-effect transistor microarray biosensor with bio-functionalized gate surfaces
II, 158 S., 2006
Das Ziel dieser Arbeit war die Biofunkionalisierung von SiO2 Gates in ionensensitiven
Feldeffekttransistoren (ISFET), um DNA Sequenzen kovalent durch eine Reihe von
chemischen Reaktionen zu binden. Es gelang, DNA Hybridisierung und insbesondere
Einzel-Nukleotid- Polymorphismen auf der modifizierten Oberfläche nachzuweisen. Des
weiteren wurde, um das Prinzip der Feldeffektdetektion zu untersuchen, der Aufbau von
Polyelektrolyten sowie die Detektion von Biotin und Streptavidin Reaktionen mit den
ISFET Biosensoren analysiert.
Bis jetzt haben Systeme basierend auf dem Etikettierungsansatz den Markt der DNA
Bioassays dominiert. Bei diesem Verfahren wird entweder die Sonden oder Ziel-DNA mit
einer fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Markierung versehen. In den
letzten Jahren sind viele alternative Verfahren vorgestellt worden, die das Markieren
umgehen. Basierend auf der Nachfrage nach schnellen, billigen, höchst empfindlichen und
markierungsfreien Systemen ist der ISFET Biosensor bestens geeignet.
In meiner Arbeit habe ich mit der Biofunktionalisierung von SiO2 Kontrollsubstraten
begonnen. Dies funkionalisierung führt zu einer kovalenten Bindung des Probenmoleküls
z.B. Einzelstrang DNA und Biotin. Für diese Oberflächenfunktionalisierung wurde ein
Protokoll eintwickelt, das aus folgenden Schritten besteht: Zuerst wir die Probe mit
MeOH/HCL für 30 min gesäubert und aktiviert. Dies generiert die höchste Dichte an -OH
Bindungen. In einem zweiten Schritt hinterlässt die Silanisierung mit
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) aus der Gasphase eine dünne und homogene
Silanschicht. Eine Vernetzung mit succinic anhydride Lösung für zwei Studen kontrollierte
die darauffolgende DNA Immobilisierung. Die DNA positionsspezifischen Matrizen für
die Hybridisierungsdetektion, wurden mittels eines Microspottersystems hergestellt. Die
DNA-DNA Hybridisierung hat eine höhere Effiktivität in Lösungen mit einer hohen
Ionenstärke (SSC Pufferlösung) und eine höhere Selektivität für SNP Detektion in
Lösungen mit einer geringen Ionenstärke (TE Pufferlösungen). Alle bioassay Protokolle
wurden erfolgreich für verkapselte ISFETs adaptiert.
Bei der Gleichstrommessung, arbeiten die ISFETs als ein potientiometrischer Biosensor,
welcher die Veränderung des Potentials der fest/flüssig Grenzschicht detektiert. Dieses
Potential wird durch ein andockendes Biomolekül verändert. Um das generelle
Detektionsprinzip zu untersuchen wurden Polyelektrolyte als Modellsystem verwendet.
Während das lagenweisen Aufbaus, verändern sich die Dicke und Ladung des PEM
systems. Dies kann mit ISFET detektiert werden. Die Aufnahmen bestätigten die
Oberflächenladungsempfindlichkeit des ISFETs. Mit zunehmenden Abstand von der
Oberfläche, nahm die Ladungsdetektion exponentiell ab.
Um die Langzeitdrift des FETS zu reduzieren und um mögliche unerwünschte Einflüsse
von Temperatur, pH Wert, Pufferlösung etc. zu verhindern wurde ein Referenzchip oder
Referenzkanal für eine differentielle Messung benutzt. Die DNA Immobilisierung
zwischen kovalenter Bindung und elektrostatischer Absorption resultierte in einer
Änderung der Gatespannung um 4mV. Dies bestätigte, dass die kovalente Bindung der
DNA Immobilisierung eine bessere Flächenabdeckung herbeiführte, als eine
elektrostatische Absorption. Die differentielle DNA Hybridisierung zwischen einer perfekt
übereinstimmenden Probe (PM) und einer vollkommen fehl angepassten Probe (FMM) gab
auch ein klares Signal. Allerdings ein Einzel-Nukleotid-Polymorphismus nur schwer im
Gleichstrommodus zu erkennen.
Darum wurden impedimetrische ISFETs entwickelt, mittels denen die Veränderung der
Impedanz im Wechselstrombereich am Gate gemessen werden konnte. In der optimierten
Detektionslösung wurde eine verlässliche Methode gefunden um ex-situ
Einzel-Nukleotid-Polymorphismen nachzuweisen. In-Situ Messungen zeigten die Kinetik
der DNA Hybridisierung. In einem ersten “Proof of principle“ Experiment wurde die
Selektivität für die Detektion von Einzel-Nukleotid Polymorphismen durch Zugabe von
gold Nanopartikeln nicht verbessert. Dies bestätigte die korrekte Ladungsempfindlichkeit
im ISFET "double layer". Des weiteren wurde in in-situ und exsitu Messungen von
Biotin/Streptavidin Bindungen eine klare Veränderung der Transferkennlinie beobachtet.
Die Aufnahmen des Multilagenaufbaus im Gleichstrom- und Wechselstrombereich ergaben
Hinweise auf das Funktionsprinzip der Detektion sowie erste Größen für die Komponenten
im elektrischen Ersatzschaltbild. Die Hauptparameter wie Leiterbahnkapazität und
Widerstand der Lösung wurden identifiziert und der Einfluss einer angehefteten
Biomembrane auf dem ISFET wurde in erster Näherung simuliert.
The aim of this work was to bio-functionalize the SiO2 gate of ion-sensitive field-effect
transistor (ISFET) to covalent bind DNA sequences via a series of chemical reactions. On
the modified surface, the detection of the DNA hybridization and in particular single
nucleotide polymorphism (SNP) detection was achieved. Furthermore, to explore the
working principle of the field-effect detection, polyelectrolyte multilayers (PEMs) buildup
and recognition reaction of biotin and streptavidin were also analyzed with the ISFET
biosensors.
Up to now, labeling detection systems dominated the DNA detection bioassays. Here either
the probe or the catcher DNA are labeled with fluorescence-, radioactive- or
enzymatic-labels. In recent years, many new approaches for signal generation that avoid
labeling have been reported. Based on the demand of a fast, cheap, highly sensitive,
label-free and direct electronic readout, ISFET biosensor are ideally suited.
In my work, I started with bio-functionalization of SiO2 control substrates, leading to a
covalent binding of the probe biomolecules, i.e. single stranded DNA and biotin. In this
surface modification process, a step-by-step protocol was setup, firstly cleaning/activation
with MeOH/HCl for 30 mins generated the highest -OH bond density. Secondly,
silanization with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) in gas phase left a thinner, more
homogeneous silane layer. Crosslinking with succinic anhydride solution for 2 hours
controlled the following DNA immobilization. The DNA position-specific microarrays for
hybridization detection were fabricated by a custom-made aligned microspotter system.
The DNA-DNA hybridization has higher efficiency in higher ionic strength solution (SSC
buffer solution) and higher selectivity for SNP detection in lower ionic strength TE buffer
solutions. All bioassay protocols were successfully transferred to the fully encapsulated
ISFET devices and were “mild” enough for the encapsulation material of the chips.
In the direct current (DC) readout, ISFETs as a potentiometric biosensors monitor the
change of the solid/liquid interface potential caused by the attachment of biomolecules. To
investigate the detection principle of the ISFETs in general, polyelectrolyte multilayers
(PEMs) were used as a model system. During the layer-by-layer buildup, the thickness of
the PEMs and the outer charge of the layer system are changing, which can be recorded by
the ISFETs. The recorded results confirmed the surface charge sensitivity of the ISFETs.
With increasing distance away from the surface, the charge detection of the ISFETs
decreased exponentially.
To reduce the long-term drift of the FET readout and exclude possible side effects from
temperature, pH changes, and buffer solutions etc., a reference chip or a reference channel
were used to perform differential readout detections. The DNA immobilization between
covalent binding and electrostatic adsorption caused a gate voltage change of 4mV. It
confirmed that the covalent binding of DNA immobilization introduced a higher surface
coverage compared to the electrostatic adsorption. The differential DNA hybridization
between a perfect matched (PM) and a fully mismatched (FMM) probe sequence also gave
a clear signal. However, the SNP is barely distinguishable in DC readout as potential
changes.
Therefore, ISFETs as impedimetric biosensors were developed to record the impedance
change at the gate input in an alternating current (AC) mode. In the optimized detection
solution, a reliable recording of ex-situ SNP was achieved and in-situ detection showed
DNA hybridization kinetically. In the first proof of principle experiment, the adding of
gold-nanoparticle (AuNPs) to the target DNA did not enhance the selectivity of the SNPs
detection, which confirmed the valid charge sensitive of ISFET in electrical double layer.
Furthermore, in-situ and ex-situ measurements of biotin/streptavidin binding revealed
distinct effects on the transfer function curves.
The recordings of the multilayer buildup in AC and DC readouts modes offered details for
the principle explanation of the signals and evidence about the main components in the
equivalent circuit simulations. The main parameters such as contact lane capacitance and
solution resistance were firstly identified and the influence of a biomembrane attached to
the ISFET gate was in a first approximation modeled.
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