Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4213
Helten, Andreas
Dynamik der cGMP-Synthese in Sehzellen - Regulation membranständiger Guanzylatzkyklasen durch modifizierte Kalzium-Sensor-Proteine
123 S., 2006
Die membrangebundenen Guanylatzyklasen GC1 und GC2 sind wichtig für die
Phototransduktion in Sehzellen. Sie bestimmen, im Wechselspiel mit einer Phosphodiesterase,
die Konzentration des intrazellulären Signalmoleküls zyklisches Guanosinmonophosphat
(cGMP). Bei niedrigen Kalzium-Konzentrationen werden die GCs von Guanylatzyklase
aktivierenden Proteinen (GCAP1 und GCAP2) aktiviert. Die cGMP-Konzentration steigt und
die Sehzelle adaptiert. Während dieses Vorgangs bildet ein GC-Dimer mit einer unbekannten
Zahl von GCAPs einen Proteinkomplex. Die Stöchiometrie und die Kalzium-abhängigen
Konformationsänderungen innerhalb dieses Proteinkomplexes sind unbekannt.
GCAP2 besitzt drei Cystein-Reste, interessanterweise jeweils einen im ersten und dritten
Kalzium-Bindungs-Motiv (EF-Hand-Motiv). In der vorliegenden Arbeit wurden Cystein-
Mutanten von GCAP2 generiert, heterolog exprimiert und gereinigt. Die EC50- und
IC50-Werte der Cystein-Mutanten waren denen von GCAP2-Wildtyp ähnlich. Jedoch
aktivierten Cystein-Mutanten, die im ersten EF-Hand-Motiv keinen Cystein-Rest besaßen, die
GCs schwächer, als dies GCAP2-Wildtyp tat. Dies zeigt, wie bedeutsam dieser Cystein-Rest
für die GC-Regulation ist.
In weiteren Experimenten untersuchte ich die Zugänglichkeit der Cystein-Reste für die
thiolreaktive Substanz 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid). Die Cystein-Reste im ersten und
dritten EF-Hand-Motiv waren nur bei niedrigen Kalzium-Konzentrationen zugänglich. Dies
war überraschend, da für das erste EF-Hand-Motiv nur eine sehr geringe Kalzium-Affinität
angenommen wird und demzufolge keine Konformationsänderung zu erwarten war. Durch die
Bestimmung der Kalzium-Sensitivitäten der DTNB-Reaktionen, die als apparente
Kalzium-Affinitäten der EF-Hand-Motive interpretiert werden können, konnte ich folgendes
Modell erstellen: Die Kalzium-Dissoziation am dritten EF-Hand-Motiv induziert eine
Konformationsänderung, die zur GC-Aktivierung führt. Ferner konnte ich nachweisen, daß
Magnesium die apparenten Kalzium-Affinitäten des ersten EF-Hand-Motivs von GCAP2 und
die des ersten und dritten EF-Hand-Motivs von GCAP1 erhöht.
Ich koppelte thiolreaktive Fluophore an die Cystein-Mutanten. Dadurch wollte ich KalziumabhängigeKonformationsänderungen im Bereich der Fluophore messen. Ebenso wollte ich
durch die Messung des Förster Resonanz Energie Transfers zwischen fluoreszenzmarkierten
GCAP2-Mutanten und fluoreszenzmarkierten GCAP1-Mutanten die gleichzeitige Bindung
beider GCAP-Isoformen an die GC1 nachweisen. Beide Versuchansätze brachten negative
Ergebnisse. Auch mit löslichen, enzymatisch aktiven GC1- Konstrukten ließen sich nicht die
erhofften Ergebnisse erzielen.
Membrane bound guanylate cyclases GC1 and GC2 are important for the phototransduction in
photoreceptors. They regulate, in an interplay with a phosphodiesterase, the concentration of the intracellular messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). At low calciumconcentrations both GCs are activated by guanylate cyclase activating proteins (GCAP1 and GCAP2). The cGMP-concentration increases and the photoreceptor adapts. If GCs become
activated a GC-dimer forms a complex with an unidentified number of GCAPs. The
stoichiometry and calcium dependent conformational changes within this complex are
unknown.
GCAP2 has three cysteine residues, interestingly one in the first and one in the third
calcium-binding-motif (EF-hand-motif). In this work cysteine mutants of GCAP2 were
generated, heterologously expressed, and purified. All cysteine mutants exhibited EC50- and
IC50-values comparable to GCAP2-wildtype. However, mutants with no cysteine residue in
the first EF-Hand-motif activated GCs weaker compared to GCAP2-wildtype. This indicates
an important function of this cysteine residue in GC-regulation.
In further experiments I investigated the accessibility of cysteine residues for the thiolreactive substance 5,5??-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid). The cysteine residues within the first and third EF-hand-motif were only accessible at low calcium concentrations. This was surprising because the first EF-hand-motif is assumed to bind calcium with only very low affinity. Thus no calcium induced conformational change was expected. By determining the calcium sensitivities of the DTNB-reaction, which could be interpreted as apparent calcium affinities of the EF-hand-motifs, I was able to develop following model: calcium dissociation from the third EF-hand-motif in GCAP2 induces a conformational change that causes GC-activation.Furthermore I demonstrated that magnesium increases the apparent calcium affinities of thefirst EF-hand-motif in GCAP2 and of the first and third EF-hand-motif in GCAP1.
I coupled thiolreactive dyes to cysteine mutants of GCAP2. Thereby I wanted to detect
conformational changes in the vicinity of the dye. Furthermore, by recording Förster
Resonance Energy Transfer between dye labeled GCAP1- and GCAP2-mutants I wanted to
show the simultaneous binding of both GCAP isoforms to GC1. Both experimental
approaches gave negative results. Using a soluble, enzymatic active GC1-construct instead of
wildtype GC1 produced also not the expected results.
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