Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4209
Skegro, Darko
Interaktionsbereiche von Arrestin zu licht-aktiviertem P-Rhodopsin
135 S., 2006
Arrestin spielt eine Schlüsselrolle in der Deaktivierung der lichtinduzierten Signalkaskade.
Nach Phosphorylierung des licht-aktivierten Rhodopsins (P-Rhodopsin*) kann Arrestin an
den Rezeptor binden und verhindert so eine weitere Interaktion von Rhodopsin mit seinem G-Protein
Transducin.
In dieser Arbeit wurden Erkenntnisse zur Bindungsregionen von Arrestin bei der
Komplexbildung mit Rhodopsin gewonnen. Zur Eingrenzung putativer Interaktionsbereiche
von visuellem, bovinem Arrestin und Rhodopsin wurden in die konkaven Seiten der N- bzw.
C-terminalen Kuppel, den a-helikalen Bereich und der "loop"-Region zwischen den Domänen
von CA-Arr (Arrestin mit Austausch von wildtypischen Cysteinen 63, 128 und 143 gegen
Alanine) Cysteine eingeführt, welche zur selektiven Bindung von verschiedenen
Fluoreszenzfarbstoffen, unter Ausbildung von stabilen Thioether-Bindungen, dienten. Es
wurden CA-Arr Arrestine mit jeweils nur einem Austausch, aber auch Proteine mit zwei, drei
und vier Austauschen erzeugt . Ein begrenzter Bereich um diese ausgetauschten Positionen
wurde mit Hilfe der großen Fluoreszenzfarbstoffe sterisch blockiert und war so für
Interaktionen mit P-Rhodopsin* unzugänglich . Aktive, markierte Arrestine wurden für
Interaktionsversuche mit licht-aktiviertem, phosphoryliertem Rhodopsin in der
zeitabhängigen statischen Lichtstreuung (KLS) eingesetzt. Während KLS-Messungen zeigten,
dass mit einfach markierten Arrestinen keine Eingrenzung des Bindungsbereich möglich ist,
konnte mit einem Arrestin, dass in jeder Kuppel zwei Farbstoffmoleküle gebunden hatte ein
signifikantes Ergebnis erzielt werden. Es konnte kein Bindungssignal mehr in der KLS
beobachtet werden. Ein Arrestin mit jeweils einem Farbstoffmolekül in jeder Kuppel zeigte
ein intermediäres Bindungssignal (reduzierte Aktivität).
Anhand der erhaltenen Resultate konnten somit die Bindungsregionen von Arrestin klar
aufgezeigt werden. Sie befinden sich in beiden kuppelartigen Domänen von Arrestin.
Im Hinblick auf weiterführende Studien könnten, außer kristallographische Analysen des
Arrestin-Rhodopsin-Komplexes, fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen (FRET) oder
Elektronen-Spin-Resonanz-Experimente (ESR) die Interaktionsbereiche zwischen Arrestin
und P-Rhodopsin* eindeutig aufzeigen.
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