Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-4203
Gande, Roland
Untersuchungen zur Lipid- und Zellwandsynthese in Corynebacterium glutamicum
128 S., 2006

Untersuchungen zur Lipid-und Zellwandsynthese in Corynebacterium glutamicum
Die Zellwand der Corynebacterianeae, zu denen unter anderem das biotechnologisch genutzte Corynebacterium glutamicum gehört, besitzt neben der Cytoplasmamembran eine zweite Lipiddoppelschicht die funktionell mit der auseren Membran Gram negativer Bakterien vergleichbar ist. Beide Membranen sind masgeblich am Stofftransport beteiligt. Diese Lipidmembranen bestehen aus Fettsäuren und Mycolsäuren. Es war das Ziel dieser Arbeit die Synthese der Mycolsäuren sowie die weiterer Zellwandbestandteile zu untersuchen.

1. In C.glutamicum wurden 4 paraloge Acyl-CoA Carboxyltransferasen entdeckt. Während accD4 keine Funktion zugesprochen werden konnte,ergab die Analyse von Inaktivierungsmutanten,sowie ein zusätzlicher Enzymtest,dass accD1 essentiell ist und zusammen mit accBC fur die Acetyl-CoA Carboxylase kodiert. Auch accD2 und accD3 sind essentiell und spezifisch an der Mycol-säuresynthese beteiligt.
2. Die Isolierung von AccD3 uber Affinitatschromatographie ergab eine Coisolation von AccD2 und AccBC. Zusammen mit den Mutationsstudien zeigt dies,dass der AccD2-AccD3-AccBC Carboxylasekomplex an der Mykolsäure-synthese beteiligt ist. Auch die Biotinylierung von AccBC konnte nachgewiesen werden,was sie als α-Untereinheit der Carboxylasen ausweist.
3. In allen Corynebacterianeae liegt im Genom benachbart zu dem für AccD3 kodierenden Gen das Gen einer Polyketidsynthase, Pks, sowie das Gen einer Acyl-AMP Ligase, FadD. Beide Proteine wurden isoliert. Die Deletion von pks führt ebenfalls zur Abwesenheit von Mykolsäuren. FadD transferiert einen Adenylrest auf eine Fettsäure. Aufgrund dieser Befunde konnte ein Mechanismus vorgeschlagen werden,der den Transfer einer Fettsäure auf Pks, sowie dessen Aktivierung durch Carboxylierung und schlieslich die Kondensation mit einer weiteren Fettäaure zur Mykolsäure beinhaltet.
4. Deletionen von Genen stromaufwärts der Polyketidsynthase, die für zum Teil sehr ähnliche Esterasen kodieren, führten zur Reduktion von an das Arabinogalaktan gebundenen Mykolsäuren, was auf deren Beteiligung am Mycolsäuretransfer hinweist. Für ein weiteres Gen konnte wahrscheinlich gemacht werden, dass es als Polyrenyltransferase an einem neuartigen Syntheseweg zur Generierung polyprenylierter Arabinose beteiligt ist, da dessen Inaktivierung zur Abwesenheit von Arabinose im Arabinogalaktan führt.

Studies on the lipid and cell wall synthesis in Corynebacterium glutamium
The Corynebacterianeae, such as Corynebacterium glutamicum or Mycobacterium tuberculosis, possess unique and structurally diverse lipids, including the genus specific mycolic acids. These α-branched, β-hydroxylated fatty acids form an outer permeability barrier not present in other gram positive bacteria. Whereas the chemical structure of mycolic acids is known, only recently details on its synthesis also emerge. This work shows the involvement of several genes of C.glutamicum in mycolic acid synthesis,transfer and translocation. The key player in this process is obviously the highly conserved polyketide synthase (pks)showing strong homology to the mycobacterial pks13. The corresponding gene product condenses two preformed linear fatty acids to yield mature mycolic acids. Additionally the whole chromosomal region adjacent to pks shows synteny in all Corynebacterianeae. The present study on pks and the adjacent accD3,whose gene product resembles the β- subunit of the acetyl-CoA carboxyltransferase in E.coli, revealed a complete loss of mycolic acids in mutants inactivated in pks or accD3. Interestingly C.glutamicum possesses four paralogous acyl-CoA carboxyltransferasesases. Isolation of His- tagged AccD3 resulted in co-purification of AccD2, one of the carboxylase paralogous together with AccBC which is the biotinylated α-subunit essential for carbon dioxide fixation. Disruption of accD2 also led to a complete loss of mycolic acids similar to the accD3 and pks inactivation mutant. Considering these results the following model is suggested:The AccD2-AccD3-AccBC complex is involved in carboxylating a linear fatty acid precursor similar to carboxylation of acetyl-CoA required for linear fatty acid synthesis catalysed by the Fas system. The carboxylated precursor is used by Pks to establish a Claisen-like condensation with a second probably not activated fatty acid to yield mature mycolic acids which are transferred into the cell wall to form an outer lipid bilayer similar to the outer membrane of gram negative bacteria.

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