Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4196
Wachten, Sebastian
Funktionelle Charakterisierung von Adenylatzyklasen der Honigbiene Apis mellifera
128 S., 2005
Adenylatzyklasen (ACs)synthetisieren den intrazellulären Botenstoff 3',5'-zyklisches
Adenosinmonophosphat (cAMP).Die physiologische Bedeutung der ACs wird im Gehirn von
Säugetieren und der Fruchtfliege Drosophila melanogaster intensiv untersucht.Es wurde
festgestellt,dass einige Isoformen des Enzyms für Lern-und Gedächtnisprozesse benötigt
werden. Ein Organismus,der sich als „Lernmodell“ besonders gut eignet,ist die Honigbiene
Apis mellifera. Sie besitzt ein umfangreiches Verhaltensrepertoire,das für Lernexperimente
leicht zugänglich ist. Testverfahren,mit denen visuelles,olfaktorisches und taktiles Lernen
analysiert werden können,sind seit langem etabliert und werden stetig erweitert.Allerdings
sind die zellulären und molekularen Grundlagen,die das Verhalten der Honigbiene steuern,
weitgehend unerforscht. Über die molekulare und biochemische Identität der ACs in der
Honigbiene,war zu Beginn meiner Arbeit nichts bekannt.
Ich habe drei Gene kloniert (Amac2,Amac3 und Amac8),die für membranständige ACs der
Honigbiene kodieren.Die Aminosäuresequenzen besitzen große Ähnlichkeit zu ACs aus
Säugetieren und Drosophila. Die heterolog exprimierten Enzyme AmAC2t und AmAC3
werden durch Forskolin und die α-Untereinheit stimulatorischer G-Proteine (Gs I)aktiviert.
Das Amac2-Gen kodiert für ein N-terminal trunkiertes Protein (AmAC2t).Es ist das erste,
trunkierte AC-Enzym,das funktionell exprimiert werden konnte.
Das Amac3-Gen wird im Gehirn der Honigbiene exprimiert. Die mRNA wurde in Neuronen
der Pilzkörper,der optischen Loben und des Deutocerebrums nachgewiesen. Zm die in vivo
Funktion der AmAC3 zu untersuchen, sollte die Amac3-Genexpression im Gehirn von
Honigbienen unterdrückt werden. Eine Chance,die Genexpression in der Honigbiene zu
beeinflussen, bietet der Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi). Der selektive mRNA-
Abbau sollte induziert werden,indem Honigbienen Amac3-spezifische,doppelsträngige RNA
(dsRNA)injiziert wurde.Diese Tiere reagierten empfindlicher auf Zucker als Kontrolltiere.
Demzufolge ist die AmAC3 in neuronale Signalwege eingebunden,die die gustatorische
Empfindlichkeit beeinflussen.Interessanterweise besaßen Tiere,denen Amac3 dsRNA
injiziert wurde,mehr Amac3-mRNA als Kontrolltiere. Dieses Ergebnis überraschte und
führte zu einer alternativen Interpretation der RNAi-Auswirkung. Weiterführende
Experimente sind notwendig,um herauszufinden,wie der RNAi-Mechanismus in der
Honigbiene tatsächlich abläuft,analysiert und als Methode etabliert werden kann.
Adenylyl cyclases (ACs)are enzymes that synthesize the intracellular messenger adenosine
3',5'-cyclic monophosphate (cAMP). The physiological impact of ACs has been intensively
investigated in the mammalian brain and in the fruitfly Drosophila melanogaster .Some of the
AC-enzymes are involved in processes underlying learning and memory. An organism,which
is well suited for learning studies,is the honeybee Apis mellifera. The bee provides a rich
behavioral repertoire that can be experimentally adressed. Within the last decades,several
tests to study visual,olfactory,and tactile learning skills of the honeybee have been
established. However,the cellular mechanisms and molecular components controlling the
bees'behavior are largely unknown. In the beginning of this study,the molecular and
biochemical properties of adenylyl cyclases in the bee had not been uncovered.
I have cloned three genes (Amac2,Amac3,and Amac8)that encode membrane-bound ACs
from honeybee brain. The amino-acid sequences have striking similarities to ACs from
mammals and Drosophila. Heterologously expressed AmAC2t and AmAC3 proteins are
activated by forskolin as well as by α-subunits of stimulatory G-proteins (GsI).The Amac2-
gene encodes an N-terminally truncated protein (AmAC2t).Notably,AmAC2t is the first
truncated AC-enzyme that could be functionally expressed.
The expression profile of the Amac3 gene was analyzed by in situ hybridization of brain-
tissue sections. The Amac3 mRNA is predominatly expressed in the mushroom bodies,the
optic lobes,and the deutocerebrum.To analyze the in vivo function of AmAC3,the
expression of the Amac3 gene should be suppressed in the brain. To pursue such analyses,
RNA interference (RNAi)is a promising technique.When Amac3-specific,double-stranded
(ds)RNA is introduced into the honeybee brain,the endogenous Amac3 mRNA-level should
be reduced.Bees that were injected with Amac3-dsRNA exhibited a higher responsiveness to
sugar compared to controls. These results suggest that AmAC3 modulates the gustatory
sensitivity of the animal. Interestingly,the injected bees had a higher amount of Amac3
mRNA than control bees. This unexpected finding evoked an alternative interpretation of the
RNAi-effect. Further experiments are necessary,however,to uncover how the RNAi
mechanism in the honeybee really works and to establish this method as a reliable tool to
study gene function in this insect.
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