Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4150
Kocan, Martina
Regulation of the phosphate starvation response in Corynebacterium glutamicum by the PhoRS two-component system
107 S., 2005
Die Erkennung von Umweltveränderungen und die notwendige Anpassung daran erfolgt
in Bakterien in vielen Fällen durch Zweikomponenten-Signaltransduktionssysteme, kurz
Zweikomponenten-Systeme genannt. Sie bestehen aus einer meist membrangebundenen
Sensorkinase, die in Abhängigkeit von spezifischen Umweltreizen den
Phosphorylierungszustand und damit die Aktivität eines Antwortregulators kontrolliert, der in
den weitaus meisten Fällen als Transkriptionsregulator fungiert. Im 3.3 Mb-Genom des grampositiven
Bakteriums Corynebacterium glutamicum wurden Gene für 13 Zweikomponenten-
Systeme identifiziert. Durch gerichtete Mutagenese wurde ein Satz von zwölf Mutanten
konstruiert, in denen die Gene für jeweils eine Sensorkinase und den dazugehörigen
Antwortregulator deletiert waren. Im einem Fall konnte nur das Gen für die Sensorkinase
deletiert werden, nicht aber das für den Antwortregulator.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eines der Zweikomponentensysteme von C.
glutamicum an der Anpassung an Phosphatmangel beteiligt ist. Dazu wurden die genannten
Mutanten unter Phosphatmangel und unter Phosphatüberschuss kultiviert. Eine der Mutanten
wuchs bei Phosphatmangel, nicht aber bei Phosphatüberschuss, deutlich schlechter als der
Wildtyp. Der Wachstumsdefekt konnte durch plasmid-gekoppelte Expression der fehlenden
Gene komplementiert werden. Diese Resultate wiesen auf eine Funktion des fehlenden
Zweikomponentensystems bei der Phosphatmangel-Antwort hin und die entsprechenden Gene
wurden daher phoS (Phosphat-Sensorkinase) und phoR (Phosphat-Response-Regulator)
genannt.
Mit dem Ziel, die Gene zu identifizieren, die durch den Antwortregulator PhoR reguliert
werden, wurden DNA-Microarray-Analysen durchgeführt. In einer ersten Serie von
Experimenten wurde das Transkriptom der ΔphoRS-Mutante vor und nach einem Wechsel
von Phosphatüberschuss zu Phosphatmangel verglichen. Dabei zeigte sich, dass mit
Ausnahme des pstSCAB-Operons die Gene, die im Wildtyp unter Phosphatmangel induziert
werden, in der Mutante nicht induziert wurden. Dies erklärt die Wachstumshemmung der
ΔphoRS-Mutante unter Phosphatmangel. Die pstSCAB-Gene, die einen hochaffinen ABCTranporter
für Phosphat kodieren, wurden in der ΔphoRS-Mutante unter
Phosphatmangelbedingungen noch partiell induziert, was auf die Existenz eines weiteren,
bisher noch unbekannten Regulators der pst-Gene hindeutet. In einer zweiten Serie von DNAMicroarray-
Experimenten wurde das Transkriptom der ΔphoRS-Mutante mit dem des
Wildtyps verglichen. Bei Phosphatüberschuss zeigten in der Mutante 27 Gene eine geringere
und 15 Gene eine höhere mRNA-Konzentration als im Wildtyp. Unter Phosphatmangel
zeigten alle bekannten Phosphatmangel-Gene (pstSCAB, ugpAEBC, glpQ, phoH, nucH and
ushA) in der Mutante einen geringere mRNA-Konzentration als im Wildtyp, was die
vorherigen DNA-Microarray-Daten unterstützt. Während im Wildtyp die mRNAKonzentration
des pitA-Gens, das für einen niedrig-affinen sekundären Phosphat-Transporter
kodiert, nach einem Wechsel zu Phosphatmangel sank, war sie in der ΔphoRS-Mutante nach
einem solchen Wechsel unverändert, beim Vergleich ΔphoRS-Mutante/Wildtyp in der
Mutante erhöht. Durch Primer-Extension-Analysen der Gene pstS, ugpA und phoR wurden
die DNA-Microarray-Daten bestätigt und die Transkriptionsstartpunkte bestimmt. Die
genannten Resultate deuten darauf hin, daß PhoR als Aktivator vieler Phosphatmangel-Gene
fungiert, aber auch als Repressor des pitA-Gens.
Um die Phosphorylierungsreaktionen zu zeigen, die charakteristisch für Zweikomponenten-
Systeme sind, wurden die Sensorkinase PhoS und der Antwortregulator PhoR
mit einem carboxyterminalen Hexahistidin-Tag modifiziert, in Escherichia coli
überproduziert und anschließend durch Affinitätschromatographie gereinigt. Die
Solubilisierung und Reinigung des integralen Membranproteins PhoS erfolgte mit dem
Detergenz N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid (LDAO). Mit den isolierten Proteinen konnte
die ATP-abhängige Autokinase-Aktivität von solubilisiertem PhoS und der
Phosphoryltransfer von phosphoryliertem PhoS auf PhoR nachgewiesen werden.
Die Bindung des Antwort-Regulators PhoR an die Promotorregionen der Operons
pstSCAB, ugpAEBC und phoRS sowie des pitA-Gens wurde durch Gelretardationsexperimente
analysiert. Mit dem vollständigen PhoR-Protein konnte unabhängig von den gewählten
Bedingungen keine Bindung gezeigt werden. Mit einem PhoR-Derivat, bei dem die
aminoterminalen 125 Aminosäuren durch einen Hexahistidin-Tag ersetzt wurden, konnte
dagegen eine Bindung an die vier oben genannten Promotorregionen nachgewiesen werden,
nicht jedoch an die Promotorregionen von clpP1P2 und clpC, die als Negativkontrollen
dienten. Zusätzlich wurde die PhoR-Bindestelle in der pstS-Promotorregion durch DNase-I-Footprint-
Experimente analysiert. Dabei wurde der Bereich 170 bis 205 bp stromaufwärts des
pstS-Transkriptionsstarts als geschützt identifiziert. Diese Resultate unterstützen eine direkte
Regulation von Phosphatmangel-Genen sowie des pitA-Gens durch das PhoS-PhoR-Zweikomponentensystem.
In bacteria, the recognition of environmental changes and the necessary adaptations to
these changes is in many cases accomplished by two-component signal transduction systems.
They are composed of a usually membrane-bound sensor kinase and a response regulator. In
response to specific environmental signals, the sensor kinase controls the phosphorylation
state of the response regulator and thus its activity. With few exceptions, response regulators
function as transcriptional regulators. Within the 3.3 Mb-genome of the gram-positive
bacterium Corynebacterium glutamicum genes for 13 two-component systems were
identified. By directed mutagenesis, a set of 12 strains was constructed each lacking the genes
for one sensor kinase and its response regulator. In one case, only the sensor kinase, but not
the response regulator could be deleted.
In this work it was tested, whether one of the two-component systems of C. glutamicum
is involved in the phosphate starvation response. To this end, the mutants mentioned above
were cultivated under phosphate excess and phosphate limitation. One of the mutants grew
poorer than the wild type under phosphate limitation, but not under phosphate excess. The
growth defect could be abolished by expression of the missing genes from a plasmid. These
results indicate a function of the deleted two-component system in the phosphate starvation
response and therefore the corresponding genes were named phoS (phosphate sensor kinase)
and phoR (phosphate response regulator).
With the aim to identify the target genes of response regulator PhoR, DNA microarray
analyses were performed. In a first set of experiments, the transcriptom of the ΔphoRS mutant
before and after a shift from phosphate excess to phosphate starvation was compared. Genes
known to be induced by phosphate starvation in the wild type were not induced in the mutant,
explaining the impaired growth of the ΔphoRS mutant under phosphate limitation. The
pstSCAB genes encoding a high-affinity ABC transporter for phosphate were still partially
induced in the ΔphoRS mutant under phosphate limitation, indicating the existence of an
additional, currently unknown regulation of the pst operon. In a second set of experiments, the
transcriptom of the ΔphoRS mutant was compared to that of the wild type. Under phosphate
excess, 27 genes showed a lower and 15 genes a higher mRNA level in the mutant compared
to the wild type. Under phosphate-limited conditions, all of the known Pi starvation-inducible
genes (pstSCAB, ugpAEBC, glpQ, phoH, nucH and ushA) showed lower mRNA levels in the
deletion mutant, sustaining the previous DNA microarray data. Interestingly, the mRNA level
of the pitA gene encoding a low-affinity Pi transporter decreased after a shift from Pi excess to
Pi limitation in the wild type, but not in the ΔphoRS mutant. By primer extension analysis of
pstS, ugpA and phoR, the DNA microarray data were confirmed and the transcriptional start
sites of these genes were determined. In summary, the data indicated that the PhoS-PhoR twocomponent
system is responsible for the activation of many phosphate starvation genes, but
also for repression of the pitA gene.
In order to demonstrate the phosphorylation reactions characteristic for two-component
signal transduction systems, the sensor kinase PhoS and the response regulator PhoR were
both modified with a carboxyterminal histidine tag, overproduced in Escherichia coli and
subsequently purified by affinity chromatography. Solubilization and purification of the
integral membrane protein PhoS were performed with the detergent N,Ndimethyldodecylamine-
N-oxide (LDAO). Both the autokinase activity of solubilized PhoS
and the phosphoryl transfer from phosphorylated PhoS to PhoR were demonstrated with the
isolated proteins.
The binding of the response regulator PhoR to the promoters of pstSCAB, ugpAEBC,
phoRS and pitA was analysed by gel shift analyses. With the entire PhoR protein it was not
possible to show binding, irrespective of the conditions applied. However, a derivative of
PhoR in which the aminoterminal 125 amino acid residues were deleted and replaced by a
histidine tag did bind to the four promoter regions mentioned above, but not to the negative
control promoters clpP1P2 and clpC. Additionally, the PhoR binding site within the pst
promoter was analysed by DNase I footprinting, which indicated a protected region localized
170 to 205 bps upstream of pstS transcriptional start site.
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