Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4145
Rüffer, Niocole
Fermentative Produktion von L-Phenylalanin mit Escherichia coli und integrierter Produktabtrennung
III, 186 S., 2004
Fermentative Produktion von L-Phenylalanin mit
Escherichia coli und integrierter Produktabtrennung
In dieser Arbeit wurde ein Fermentationsprozess mit integrierter Produktabtrennung zur
Produktion von L-Phenylalanin mit rekombinanten Escherichia coli Zellen entwickelt.
Die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin wird zur Herstellung des Süßstoffs Aspartam
verwendet und ist damit eine der wichtigsten kommerziell produzierten Aminosäuren.
Im Gegensatz zu chemo-enzymatischen Verfahren kann fermentativ enantiomerenreines
L-Phenylalanin aus Glucose hergestellt werden. Daher wurden basierend auf einem
Fermentationsprozess im Zulaufverfahren im 20 l Bioreaktor mit Regelung der Glucoseund
L-Tyrosin-Zufuhr prozesstechnische Ansätze zur Verbesserung der L-Phenylalanin-
Produktion untersucht. Dazu wurden rekombinante, L-Tyrosin-auxotrophe Escherichia
coli mit Deregulierungen im Aromatenbiosyntheseweg und unterschiedlichen Glucoseaufnahmesystemen
verwendet. In Untersuchungen zur L-Phenylalanin-Produktion mit verschiedenen
Stämmen wurde gezeigt, dass die für die Produktion geeignete Glucosekonzentration
im Medium abhängig vom Glucoseaufnahmesystem des Stamms war. Der beste
Produktionsstamm wurde identifziert. Dieser wurde in Untersuchungen zum Einfluss von
Prozessparametern wie Temperatur und pH-Wert sowie Medienbestandteilen eingesetzt.
Daraus ergab sich, dass die Raum-Zeit-Ausbeute bei 37 °C am höchsten war, die Produktion
jedoch durch eine hohe L-Phenylalanin-Konzentration (>180-200 mmol/l) inhibiert
wurde. Zur Vermeidung einer Produktinhibierung und Verbesserung des Produktionsprozesses
wurde ein neues Verfahren zur integrierten Produktabtrennung mittels Kationenselektiver
Reaktivextraktion in Zentrifugalextraktoren entwickelt. In Online-Extraktionen
wurde die technische Realisierbarkeit, insbesondere die Phasentrennung und die Stabilität
des Systems gezeigt und geeignete Bedingungen für eine Online-Extraktion identifziert.
Durch die Integration der Reaktivextraktion aus zell- und proteinfreiem Permeat in den
Fermentationsprozess wurde die Produktbildungsphase deutlich verlängert und bis zum
Ende 0,25 mmol/(g·h) L-Phenylalanin produziert. Dabei wurde die Nebenproduktbildung
reduziert und das L-Phenylalanin mittels der Extraktion aufkonzentriert. Die Produktkonzentration
konnte relativ zum Prozess ohne integrierte Abtrennung um 34 % und die
Produkt-Substrat-Selektivität um 28 % gesteigert werden.
Fermentative production of L-phenylalanine with
Escherichia coli and integrated product separation
In this work a fermentation process with integrated product separation for the production
of L-phenylalanine with recombinant Escherichia coli was developed. The aromatic amino
acid L-phenylalanine is used for the production of the low-calorie sweetener aspartame. It
is one of the most important commercially produced amino acids. In contrast to the chemo-
enzymatic processes enantiomeric pure L-phenylalanine can be produced in fermentation
processes based on glucose. Therefore, technical approaches were investigated to improve
the L-phenylalanine production, based on a 20 l fed-batch fermentation process with
control of glucose and L-tyrosine feeding. Recombinant L-tyrosine auxotrophic E. coli
strains with deregulations in the aromatic biosynthesis pathway and different glucose
uptake systems were used. Investigations of the L-phenylalanine production with diffe-
rent strains showed that the glucose concentration suitable for production is dependent
on the glucose uptake system of the strain. The best production strain was identified
and used for investigations of the influence of process parameters as temperature, pH
and medium components. The space-time yield was highest at 37 °C but production was
inhibited by high L-phenylalanine concentration (>180-200 mmol/l). To avoid a product
inhibition and improve the production process a novel approach for integrated separation
of L-phenylalanine from a fermentation process with cation-selective reactive extraction
in centrifugal extractors was developed. In online experiments good phase separation and
stability of the system were shown. Suitable conditions for online extraction were identified.
By integration of reactive extraction from cell and protein free permeate in the
fermentation process the production phase was significantly extended and 0,25 mmol/(g·h)
L-phenylalanine produced until the end of the fermentation. The byproduct formation was
reduced and L-phenylalanine concentrated via the extraction. The product concentration
was increased by 34 % and the product-substrate selectivity was increased by 28 % relative
to the process without integrated separation.
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