Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4142
Rohland, Cornelia
Klonierung und heterologe Expression der Guanylatzyklase-D (GC-D) aus der Maus und Entwicklung von Aktivitätstests zur Ligandensuche
IX, 135 S., 2004
In den meisten Riechzellen von Wirbeltieren beginnt die Signaltransduktion mit der Bindung
von Duftstoffen an G-Protein-gekoppelte Duftstoffrezeptoren in der Zilienmembran . Durch
Aktivierung des Duftstoffrezeptors wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die zur Synthese
des intrazellulären Botenstoffs cAMP führt. In einer kleinen Subpopulation von Riechzellen
scheint dagegen ein cGMP-abhängiger Signalweg stattzufinden, da hier die Komponenten des
cAMP-Signalweges nicht nachgewiesen werden konnten. In diesen Zellen wird eine
membrangebundene Guanylatzyklase (GC), die GC-D, exprimiert. Der physiologische Ligand
der GC-D ist unbekannt. Man vermutet jedoch, daß das Protein durch Pheromon-ähnliche
Duftstoffe aktiviert wird, die das das Brutpflege- bzw. Säugeverhalten steuern .
In der vorliegenden Arbeit wurde die cDNA der GC-D aus genomischer Maus-DNA kloniert.
Die GC-D konnte mit Hilfe spezifischer Antikörper in einzelnen Neuronen des olfaktorischen
Epithels der Maus lokalisiert werden. Die GC-D wurde heterolog in eukaryontischen
Zelllinien exprimiert. Es wurden zwei Testsysteme entwickelt, mit denen die Aktivität des
mGC-D Proteins gemessen werden kann. Mit diesen Testsystemen ist es in zukünftigen
Experimenten möglich, den Liganden der GC-D zu identifizieren. Bei dem ersten Testsystem
handelt es sich um ein in vitro System, bei dem die Aktivierung des mGC-D Proteins über die
Menge an gebildetem cGMP erfaßt werden kann. In Abwesenheit des Liganden konnte eine
geringe GC-D Aktivität, die Basalaktivität, gemessen werden. Um die Empfindlichkeit des
Systems zu steigern, kann das rekombinante mGC-D Protein solubilisiert und über
Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Hierfür wurde ein Aufreinigungsprotokoll
erstellt, das in weiteren Schritten optimiert werden muß. Bei dem zweiten Testsystem handelt
es sich um ein zelluläres System, bei dem die GC-D mit einem cGMP-gesteuerten Ionenkanal
in einer eukaryontischen Zelllinie stabil koexprimiert wird. Die Aktivierung der GC-D durch
einen Liganden führt zur cGMP-Synthese. cGMP bindet an den Ionenkanal, der sich
daraufhin öffnet, und Ca2+ aus dem extrazellulären Medium strömt in die Zellen ein. Der
Cal+-Einstrom wird über einen Cal+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff verfolgt. Dieses System
ist aufgrund der Signalverstärkung durch die Ionenkanäle besonders empfindlich.
Der Ligand der GC-D kann in weiteren Experimenten mit den etablierten Systemen
identifiziert werden. Hierfür sollen verschiedene Körperflüssigkeiten aus der Maus in
Einzelkomponenten aufgetrennt und mittels beider Testsysteme auf eine mögliche
Aktivierung der GC-D hin untersucht werden.
Signal transduction in most olfactory sensory neurons of vertebrates is initiated by the binding
of odorants to G-protein-coupled receptors in the ciliary membrane. The activation of the
odorant receptor initiates a signal transduction cascade leading to an increase of intracellular
cAMP. In a small subpopulation of olfactory sensory neurons, a cGMP-dependent pathway
seems to be involved, since none of the components of the cAMP pathway were found in
these cells. These neurons express a membrane bound guanylate cyclase, the GC-D. The
physiological ligand of the GC-D has not been identified yet. The GC-D may be activated by
pheromone-like odorants that control social behavior and suckling.
In the present study the cDNA of the GC-D from mouse (mGC-D) was cloned from genomic
DNA. Specific antibodies against the GC-D were used to localize the protein in the
subpopulation of olfactory sensory neurons in the mouse olfactory epithelium. The mGC-D
protein was expressed in eucaryontic cell lines. Two assays were developed to measure the
protein activity of GC-D with the goal of detecting the physiological ligand of the protein.
The first assay is an in vitro system. Here, the activation of the mGC-D protein is measured
by the amount of cGMP formed by the protein. A small GC-D activity, the basal activity,
could be measured in the absence of ligand. In order to increase the sensitivity of the assay,
the recombinant mGC-D protein can be solubilised and purified by affinity chromatography .
A purification protocol was tested and has to be optimized. The second assay is a cellular
system. Here, the GC-D and a cGMP-sensitive ion channel are coexpressed in an eucaryontic
cell line. The binding of the ligand leads to the activation of GC-D. The increase of formed
cGMP inside the cell opens the ion channels. Ca2+ ions from the extracellular medium flow
into the cell. The intracellular Ca2+ concentration can be monitored by Ca2+-sensitive
fluorescence dyes. This assay is very sensitive due to signal amplification by the Ca2+ influx
through opened ion channels.
In further experiments the ligand of the GC-D may be identified using the described assays.
Various body fluids of mice should be divided in their single components and applicated in
the assays, in order to detect a possible activation ofthe GC-D.
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