Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-4124
Lange, Christian
Regulation durch verzweigtkettige Aminosäuren in Corynebacterium glutamicum
V, 128 S., 2004

In dieser Arbeit wurde die Regulation der Genexpression von Corynebacterium glutamicum durch L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin sowie durch den Transkriptionsregulator Lrp charakterisiert. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

1. Die verzweigtkettigen Aminosäuren können von C. glutamicum nicht als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle genutzt werden. Zu hohe intrazelluläre Konzentrationen von Valin, Leucin oder Isoleucin werden daher durch Export über den kürzlich beschriebenen Exporter BrnFE reduziert. Die Anwesenheit von 100 mM Leucin oder Isoleucin im Kulturmedium führte zu einer leichten Wachstumshemmung des Wildtyp-Stammes, während Valin in dieser Konzentration keinen Effekt zeigte. Die Expression von drei Biosynthesegenen verzweigtkettiger Aminosäuren (ilvN, leuC, leuD) wurde in Anwesenheit der Aminosäuren reprimiert.

2. Im Gegensatz zum Wildtyp führte die Anwesenheit von Valin und Leucin zu einer starken Wachstumshemmung des Valin-produzierenden Stammes C. glutamicum VAL1 (13032ΔilvAΔpanBC(pJC1ilvBNCD)). Transkriptomanalysen mit DNA-Chips, Proteomanalysen und Enzymtests zeigten überraschenderweise durch Valin erhöhte mRNA-, Protein- und Aktivitätsverhältnisse der Acetohydroxysäuresynthase (ilvBNGenprodukt) im VAL1-Stamm, nicht aber im Wildtyp. Da der inhibitorische Effekt von Valin und Leucin durch eine erhöhte Isoleucin-Konzentration aufgehoben werden konnte, war er auf eine Isoleucin-Limitation des isoleucinauxotrophen VAL1- Stammes zurückzuführen. Verursacht wird diese Limitation dadurch, dass alle drei verzweigtkettigen Aminosäuren durch denselben Transporter BrnQ in die Zelle transportiert werden und folglich hohe Konzentrationen von Valin oder Leucin die Aufnahme des Supplements Isoleucin kompetitiv inhibieren. Als Beweis für diesen Mechanismus konnte gezeigt werden, dass Valin und Leucin nicht inhibierend auf VAL1 wirken, wenn das Supplement Isoleucin in Form des Dipeptids Isoleucyl- Isoleucin angeboten wird, welches nicht über BrnQ in die Zelle aufgenommen wird.

3. Das Gen für den Transkriptionsregulator Lrp („Leucine responsive regulatory protein”) liegt divergent zu den Genen brnFE für den Exporter verzweigtkettiger Aminosäuren. Ein Transkriptom-Vergleich von Wildtyp und lrp-Deletionsmutante ergab, dass die Expression von 60 Genen direkt oder indirekt von Lrp beeinflusst wird. Mit Hilfe der „ChIP-to-chip”-Technik, die eine Identifizierung der DNA-Bereiche ermöglicht, an die Lrp in vivo bindet, konnten nur drei Fragmente identifiziert werden. Dies spricht für eine Funktion von Lrp als lokalem Regulator. Unter den drei Bereichen befand sich die Promotorregion zwischen lrp und brnFE. Die Bindepositionen von Lrp in diesem Bereich, die in vitro durch DNase I-Footprints mit gereinigtem Lrp-Protein bestimmt wurden, wiesen darauf hin, dass Lrp als Aktivator der brnFE-Gene und als Repressor des lrp-Gens fungiert. Im Einklang damit konnte bereits früher gezeigt werden, dass der Export verzweigtkettiger Aminosäuren in einer lrp-Mutante stark reduziert ist. Die Vielzahl an Genexpressionsunterschieden in der lrp-Deletionsmutante sowie die Wachstumshemmung durch verzweigtkettige Aminosäuren beruhen wahrscheinlich auf der fehlenden brnFE-Induktion und den dadurch bedingten erhöhten intrazellulären Konzentrationen der Aminosäuren.

In this work, global gene expression changes of Corynebacterium glutamicum in the presence of L-valine, L-leucine or L-isoleucine and regulation due to the transcriptional regulator Lrp were characterised. The following results were obtained:

1. C. glutamicum is not able to utilize branched chain amino acids as carbon or nitrogen sources. For that reason, export via the recently identified exporter BrnFE is thought to reduce exceedingly high intracellular valine, leucine or isoleucine concentrations. The presence of 100 mM leucine or isoleucine in the culture medium caused a slight growth inhibition of the wild type while the same concentration of valine had no effect. Expression of three genes of branched chain amino acid biosynthesis (ilvN, leuC, leuD) was repressed in the presence of these amino acids.

2. In contrast to the wild type, the valine production strain C. glutamicum VAL1 (13032ΔilvAΔpanBC(pJC1ilvBNCD)) showed severe growth inhibition in the presence of valine or leucine. Transcriptome analyses with DNA microarrays, proteome analyses and enzyme assays revealed unexpectedly increased mRNA, protein and activity ratios of the acetohydroxy acid synthase (ilvBN gene product) due to valine in VAL1, but not in the wild type. As the inhibitory effect of valine and leucine was relieved through an increased isoleucine concentration, it could be ascribed to an isoleucine limitation in the isoleucine auxotrophic strain VAL1. This limitation is caused by the fact that all three branched chain amino acids are taken up into the cell via the same transporter, BrnQ. Thus, high valine or leucine concentrations competitively inhibit the uptake of the supplement isoleucine. This mechanism was proven by relieve of the valine or leucine inhibition if isoleucine was supplied in the form of the dipeptide isoleucyl-isoleucine which is not imported into the cell via BrnQ.

3. In C. glutamicum, the gene encoding the transcriptional regulator Lrp (“Leucine responsive regulatory protein”) is arranged divergently to the adjacent genes brnFE of the branched chain amino acid exporter. A comparison of the transcriptomes of the wild type and an lrp deletion mutant showed that expression of 60 genes was directly or indirectly regulated by Lrp. By means of the “ChIP-to-Chip” method, which allowed identification of DNA sequences directly bound to Lrp in vivo, three DNA fragments were identified. This indicated a local role for the regulator Lrp. Among these three DNA fragments was the promoter region between lrp and brnFE. The exact binding position of Lrp in this region was determined in vitro by DNase I Footprinting with purified Lrp and indicated activation of brnFE transcription and a negative autoregulation of lrp transcription. In accordance with this model, a strongly reduced export of branched chain amino acids in the lrp deletion mutant was shown previously. The multitude of gene expression changes in the lrp deletion mutant and the growth inhibition in the presence of branched chain amino acids are a likely consequence of the lack of brnFE induction that caused increased intracellular concentrations of these amino acids.

Neuerscheinungen

• Neuerscheinungen des Verlagskatalogs

Schriften des Forschungszentrums Jülich

• Allgemeines
• Bibliothek
• Bioorganische Chemie
• Energie & Umwelt
• Gesundheit
• IAS Series
• Information
• Modeling and Simulation
• NIC Series
• PTJ Schriftenreihe
• Schlüsseltechnologien

Ihre Ansprechperson

Heike Lexis
+49 2461 61-5367
zb-publikation@fz-juelich.de