Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4113
Putzier, Ilva
Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle und Cl--Akkumulation in Sinneszellen der Ratte
VIII, 137 S., 2004
In den meisten Wirbeltier-Neuronen leiten Cl--Ströme einen inhibitorischen Cl--Auswärtsstrom . Einen
gegenteiligen Effekt haben Cl--Kanäle in somatosensorischen Neuronen und Riechzellen, wo sie eine
Depolarisation bewirken. Bei beiden Zelltypen ist die Aktivierung des Cl--Stroms an zytoplasmatische
Ca2+-Signale gekoppelt. So wird z.B. der Rezeptorstrom der Riechzellen zum größten Teil von einem
Ca2+-aktivierten Cl--Kanal getragen. Obwohl Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle von mehreren Arbeitsgruppen
elektrophysiologisch in vielen Zellen nachgewiesen wurden, konnte bisher kein verantwortliches Gen
identifiziert werden. Den Produkten der clca-Genfamilie werden allerdings die Eigenschaften Ca2+-
aktivierter Cl--Kanäle zugeschrieben. Die bislang klonierten clca-Gene stammen allesamt aus nichtneuronalen
Geweben. In unserer Arbeitsgruppe wurde das erste neuronale Homolog, rclcal, aus dem
Riechepithel der Ratte kloniert.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob rclcal für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal der
Riechsignalkaskade kodiert. Dazu wurde das rCLCAI-Protein zunächst mittels spezifischer
Antikörper biochemisch charakterisiert und mit anderen CLCA-Proteinen verglichen : rCLCAI ist ein
glykosyliertes, 125 kDa großes Membranprotein mit vier Transmembrandomänen . Es wird - wie
einige andere CLCA-Proteine - proteolytisch in ein 35 kDa und ein 97 kDa-Fragment gespalten. Es
wird gezeigt, dass beide Fragmente in Zilienproteinen gegenüber dem gesamten olfaktorischen Epithel
schwach angereichert sind, so wie es für alle Proteine der Riechsignalkaskade beschrieben wurde. In
der hnmunhistochemie konnte das rCLCAI-Protein jedoch nicht in olfaktorischen Zilien, sondern in
Tight-Junction-Strukturen lokalisiert werden. Die funktionelle Untersuchung ergab, dass rclcal -
transfizierte Zellen zwar eine zusätzliche Cl--Leitfähigkeit erhielten, die sich jedoch grundlegend vom
nativen Strom der Riechzellen unterschied. Die Untersuchung der Riechzelllinie Odora ergab
schließlich, dass rCLCAI nicht der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal der Riechsignalkaskade sein kann, da
diese Zellen zwar den bekannten Ca2+-aktivierten Cl--Strom zeigten, jedoch weder das rclcal-Gen
noch das entsprechende Protein exprimierten.
Ca2+-aktivierte Cl--Ströme depolarisieren somatosensorische Neurone und Riechzellen, da diese
Zellen, im Gegensatz zu den meisten ZNS-Neuronen, eine besonders hohe [Cl-]i besitzen. In dieser
Arbeit wurde erstmalig die Fluoreszenz-Lebenszeit-Analyse verwendet, um die [Cl-]i frisch
dissoziierter, somatosensorischer Neurone zu bestimmen. Mit ca. 30 mM ist sie tatsächlich so hoch,
dass ein Cl--Strom die Aktivierung dieser Neurone bewirken kann. Die [Cl-]i der Neurone wird durch
die Expression verschiedener Cl--Transportmoleküle bestimmt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe RTPCR-
Experimenten und Immunhistochemie gezeigt, dass weder Riechzellen noch somatosensorische
Neurone die bekannten Kationen/Cl--Kotransporter zur Cl--Akkumulation exprimieren. Die Cl-
-Akkumulation kann in diesen Nervenzellen somit nur durch einen aktiven -Transport funktionieren.
While inhibiting most neurons of the central nervous system (CNS), Cl--currents activate
somatosensory neurons and olfactory sensory neurons (OSN). Both cell types show Cl--
currents coupled to intracellular Ca2+-signalling. The receptor current of OSN is mostly
carried by a Ca2+-acitvated Cl--current. While Ca2+-activated Cl--currents have already been
detected by electrophysiological means in a variety of cells, no coding gene has been
identified yet. Only one family of proteins seem to show properties of Ca2+-activated Cl--
channels: the CLCA-proteins, which have been cloned from non-neuronal epithelia . We have
now cloned the first neuronal clca-gene from olfactory epithelium, rclcal, which could be
localized in neuronal cells of the olfactory epithelium only.
This thesis deals with the hypothesis that rclcal codes for the Ca2+-activated Cl--channel of
the olfactory signal transduction cascade. rCLCA1-specific antibodies have been generated to
characterize and compare the rclcal-protein with other CLCA-proteins . rCLCAI is a
glycosylated 125 kDa membrane protein with four transmembrane domains. It is
proteolytically cleaved into two 35 kDa and 97 kDa proteins. Both rCLCAI-fragments are
slightly enriched in olfactory cilia in comparison with whole olfactory epithelium. This has
been shown for all olfactory signalling cascade-proteins. However, on slices of olfactory
epithelium rCLCAI-antibodies do not localize the protein in cilia but detect tightjunction
structures . Functional expression of rCLCA1 shows, that it generates an enhanced Cl--
conductance in rclcal-transfected cells which has completely different properties than the
native Cl--current of OSN. By examining rCLCA1 in Odora cells, an OSN-cell lineage, it
could be proved that rclcal can not code for the Ca2+-activated Cl--channel in OSN : Although
Odora cells showed large Ca2+-acitvated Cl--currents with properties of the native current, the
rclcaI -gene and its protein could not be detected in these cells.
Ca2+-activated Cl--currents do depolarize somatosensory neurons and OSN, because these
neurons have an outstandingly high [Cl-]i compared with most CNS-neurons. In this thesis the
[Cl-]i of freshly dissociated somatosensory neurons has been measured by fluorescencelifetime
imaging (FLIM) for the first time. The [Cl-]i was 30 MM, thus Cl- currents can indeed
activate somatosensory neurons. The [Cl-]i is determined by the expression of different
chloride-transport molecules, like the cation/Cl--cotransporter (CCC) proteins. This thesis
shows that both OSN and somatosensory neurons do not express KCC2, the CCC-molecule
that leads Cl- out of most neurons. In addition to this both types of neurons do not express
NKCCL The Cl--accumulation process could not be elucidated by this thesis but an active Cl-
-accumulation process will be discussed.
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