Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-4113
Putzier, Ilva
Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle und Cl--Akkumulation in Sinneszellen der Ratte
VIII, 137 S., 2004

In den meisten Wirbeltier-Neuronen leiten Cl^--Ströme einen inhibitorischen Cl^--Auswärtsstrom . Einen gegenteiligen Effekt haben Cl^--Kanäle in somatosensorischen Neuronen und Riechzellen, wo sie eine Depolarisation bewirken. Bei beiden Zelltypen ist die Aktivierung des Cl^--Stroms an zytoplasmatische Ca²⁺-Signale gekoppelt. So wird z.B. der Rezeptorstrom der Riechzellen zum größten Teil von einem Ca²⁺-aktivierten Cl^--Kanal getragen. Obwohl Ca²⁺-aktivierte Cl^--Kanäle von mehreren Arbeitsgruppen elektrophysiologisch in vielen Zellen nachgewiesen wurden, konnte bisher kein verantwortliches Gen identifiziert werden. Den Produkten der clca-Genfamilie werden allerdings die Eigenschaften Ca²⁺- aktivierter Cl^--Kanäle zugeschrieben. Die bislang klonierten clca-Gene stammen allesamt aus nichtneuronalen Geweben. In unserer Arbeitsgruppe wurde das erste neuronale Homolog, rclcal, aus dem Riechepithel der Ratte kloniert.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob rclcal für den Ca²⁺-aktivierten Cl^--Kanal der Riechsignalkaskade kodiert. Dazu wurde das rCLCAI-Protein zunächst mittels spezifischer Antikörper biochemisch charakterisiert und mit anderen CLCA-Proteinen verglichen : rCLCAI ist ein glykosyliertes, 125 kDa großes Membranprotein mit vier Transmembrandomänen . Es wird - wie einige andere CLCA-Proteine - proteolytisch in ein 35 kDa und ein 97 kDa-Fragment gespalten. Es wird gezeigt, dass beide Fragmente in Zilienproteinen gegenüber dem gesamten olfaktorischen Epithel schwach angereichert sind, so wie es für alle Proteine der Riechsignalkaskade beschrieben wurde. In der hnmunhistochemie konnte das rCLCAI-Protein jedoch nicht in olfaktorischen Zilien, sondern in Tight-Junction-Strukturen lokalisiert werden. Die funktionelle Untersuchung ergab, dass rclcal - transfizierte Zellen zwar eine zusätzliche Cl^--Leitfähigkeit erhielten, die sich jedoch grundlegend vom nativen Strom der Riechzellen unterschied. Die Untersuchung der Riechzelllinie Odora ergab schließlich, dass rCLCAI nicht der Ca²⁺-aktivierte Cl^--Kanal der Riechsignalkaskade sein kann, da diese Zellen zwar den bekannten Ca²⁺-aktivierten Cl^--Strom zeigten, jedoch weder das rclcal-Gen noch das entsprechende Protein exprimierten.
Ca²⁺-aktivierte Cl^--Ströme depolarisieren somatosensorische Neurone und Riechzellen, da diese Zellen, im Gegensatz zu den meisten ZNS-Neuronen, eine besonders hohe [Cl^-]_i besitzen. In dieser Arbeit wurde erstmalig die Fluoreszenz-Lebenszeit-Analyse verwendet, um die [Cl^-]_i frisch dissoziierter, somatosensorischer Neurone zu bestimmen. Mit ca. 30 mM ist sie tatsächlich so hoch, dass ein Cl^--Strom die Aktivierung dieser Neurone bewirken kann. Die [Cl^-]_i der Neurone wird durch die Expression verschiedener Cl^--Transportmoleküle bestimmt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe RTPCR- Experimenten und Immunhistochemie gezeigt, dass weder Riechzellen noch somatosensorische Neurone die bekannten Kationen/Cl^--Kotransporter zur Cl^--Akkumulation exprimieren. Die Cl^- -Akkumulation kann in diesen Nervenzellen somit nur durch einen aktiven -Transport funktionieren.

While inhibiting most neurons of the central nervous system (CNS), Cl^--currents activate somatosensory neurons and olfactory sensory neurons (OSN). Both cell types show Cl^-- currents coupled to intracellular Ca²⁺-signalling. The receptor current of OSN is mostly carried by a Ca²⁺-acitvated Cl^--current. While Ca²⁺-activated Cl^--currents have already been detected by electrophysiological means in a variety of cells, no coding gene has been identified yet. Only one family of proteins seem to show properties of Ca²⁺-activated Cl^-- channels: the CLCA-proteins, which have been cloned from non-neuronal epithelia . We have now cloned the first neuronal clca-gene from olfactory epithelium, rclcal, which could be localized in neuronal cells of the olfactory epithelium only.
This thesis deals with the hypothesis that rclcal codes for the Ca²⁺-activated Cl^--channel of the olfactory signal transduction cascade. rCLCA1-specific antibodies have been generated to characterize and compare the rclcal-protein with other CLCA-proteins . rCLCAI is a glycosylated 125 kDa membrane protein with four transmembrane domains. It is proteolytically cleaved into two 35 kDa and 97 kDa proteins. Both rCLCAI-fragments are slightly enriched in olfactory cilia in comparison with whole olfactory epithelium. This has been shown for all olfactory signalling cascade-proteins. However, on slices of olfactory epithelium rCLCAI-antibodies do not localize the protein in cilia but detect tightjunction structures . Functional expression of rCLCA1 shows, that it generates an enhanced Cl^-- conductance in rclcal-transfected cells which has completely different properties than the native Cl^--current of OSN. By examining rCLCA1 in Odora cells, an OSN-cell lineage, it could be proved that rclcal can not code for the Ca²⁺-activated Cl^--channel in OSN : Although Odora cells showed large Ca²⁺-acitvated Cl^--currents with properties of the native current, the rclcaI -gene and its protein could not be detected in these cells.
Ca²⁺-activated Cl^--currents do depolarize somatosensory neurons and OSN, because these neurons have an outstandingly high [Cl^-]_i compared with most CNS-neurons. In this thesis the [Cl^-]_i of freshly dissociated somatosensory neurons has been measured by fluorescencelifetime imaging (FLIM) for the first time. The [Cl^-]_i was 30 MM, thus Cl^- currents can indeed activate somatosensory neurons. The [Cl^-]_i is determined by the expression of different chloride-transport molecules, like the cation/Cl^--cotransporter (CCC) proteins. This thesis shows that both OSN and somatosensory neurons do not express KCC2, the CCC-molecule that leads Cl^- out of most neurons. In addition to this both types of neurons do not express NKCCL The Cl^--accumulation process could not be elucidated by this thesis but an active Cl^- -accumulation process will be discussed.

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