Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4112
Link, Thomas
Glukoselimitierung als Strategie zur Steigerung von MUC1 und anderen rekombinanten Glykoproteinen mit CHO-Zellen
XIII, 135 S., 2004
Eine Reihe von wissenschaftlichen Arbeiten beschäftigt sich mit Glukose-limitierten Perfusionskulturen
um den Stoffwechsel von Säugerzellkulturen zu verbessern. Ziel ist dabei eine
effizientere Nutzung von Substraten sowie eine reduzierte Bildung cytotoxischer Metabolite
(z.B. Laktat).
Diese Arbeit zeigt die Entwicklung eines sehr gut reproduzierbaren Glukose-limitierten Perfusionsprozesses
mit einer rekombinanten CHO Zelllinie, welche humanes MUC-1 Glykoprotein
produziert (derzeit ein Kandidat zur Immuntherapie gegen Brustkrebs). Im Rahmen der
Prozessentwicklung wurden ein Standard Rührkessel Bioreaktor mit Zellrückhaltung über
Spinfilter sowie ein Protein freies Kulturmedium verwendet. Die Strategie zeichnet sich durch
einfache Durchführbarkeit aus und bedarf nicht einer online Glukose-Analytik oder anderer
invasiver Messverfahren, was sie sehr unanfällig gegenüber Störeinflüssen macht. Unter Nutzung
dieser Strategie konnte die Glukoseverbrauchsrate erheblich gesenkt werden. Dabei fällt
und verbleibt die Restkonzentration an Glukose im Bioreaktor unterhalb der Nachweisgrenze.
Die Zellen bilden keinerlei Laktat mehr und die zellspezifische Produktivität sowie die Raum
Zeit Ausbeute steigen um den Faktor 5 bzw. Faktor 4 an (250mg/L/Tag) . Die Lebendzelldichte
bleibt mit 1-2*E7 sehr hoch bei Prozesslaufzeiten von über 1000h. Weiterhin konnte mittels
detaillierter Glykoanalytik gezeigt werden, dass die Produktglykosylierung durch die
neue Prozessstrategie nicht verändert wird.
Basierend auf erste Ergebnisse durch Substratbilanzierungen und 13C-Laktat Fütterungsexperimente,
welche ein Umschwenken des Stoffwechsels zu gesteigerter Citratzyklusaktivität
zeigen und auf Glukoneogenese hindeuten, konnte ein Stoffwechselmodel aufgestellt werden.
Dieses wird im Detail diskutiert.
Schließlich konnte die Strategie auf eine zweite rekombinante CHO Zelllinie, welche ein anderes
Mucin produziert, erfolgreich übertragen werden.
Many researchers are interested in glucose-limited perfusion culture in order to improve cellular
metabolism towards more efficient substrate consumption and reduced production of cytotoxic
metabolites (e.g. lactate).
This work presents the development of a highly reproducible glucose-limited perfusion process
using a recombinant CHO cell line producing human MUC-1 glycoprotein (currently under
evaluation for immunotherapy of breast cancer) in a standard stirred vessel bioreactor with
cell retention by spin filter using serum-free medium. The strategy is easy to perform and
does not need any online glucose or other invasive measurement making the process highly
stable against disturbances . Using this strategy, glucose consumption rate decreases, glucose
concentration in the bioreactor drops and remains below detectable levels and the cells do not
longer produce any lactate, while cell specific productivity and space time yield increase 5-
fold and 4-fold respectively (250mg/L/day). Viable cell density remains very high at 1-2*E7
cells/mL. Process time can easily be extended to more than 1000h. The glycosylation pattern
ofthe product is unaffected, as shown by detailed glycoanalysis.
Based on preliminary results from substrate bilancing and 13C-lactate feeding experiments
which prove a switch in metabolism towards an increased TCA-cycle activity and which indicate
gluconeogenesis, a metabolic model has been set up and is discussed in detail.
Finally this process strategy has been transferred successfully to a second recombinant CHO
cell line secreting another mucin.
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