Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4111
Fischbach, Tina
Innovative Strategien zur Expansion hematopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen im klinisch relevanten Maßstab
V, 221 S., 2004
Die gezielte Expansion hematopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut
stellt nach wie vor eine Herausforderung in der modernen Biotechnologie dar. Die unterschiedlichen
und sehr komplexen Mechanismen, die in vivo für die Regulation der Hematopoiese
sorgen, sind nur in Teilen bekannt, und der Grad ihrer Vernetzung erschwert die Aufklärung
der physiologischen Vorgänge. Allerdings konnte in etlichen Experimenten die besondere
Rolle, die den stromalen Zellen des Knochenmarks bei der Steuerung so unterschiedlicher
Prozesse wie Differenzierung, Reifung, Expansion, Apoptose etc. zufällt, nachgewiesen
werden . Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Kultursysteme machen sich
diese Erkenntnis zunutze . Der erste Abschnitt der Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung
des Prozesses zur Herstellung konditionierter Medien durch Variation verschiedener Parameter
und unter Verwendung von drei stromalen, murinen Zellinien . Ferner wurden die beobachteten
Unterschiede der Medien unter Zuhilfenahme molekularbiologischer Techniken
weiter untersucht . Dies hat zur Identifizierung eines Proteins geführt, dessen isolierte Wirkung
auf hematopoietischen Zellen der Wirkung des konditionierten Mediums, aus welchem
es gewonnen wurde, entsprach . Im zweiten Abschnitt wurde die Wechselwirkung der hematopoietischen
Zellen mit den stromalen Zellen auf wesentlich komplexere Weise nachgestellt,
um dadurch eine effizientere Nachahmung der Hämatopoiese bzw. der gezielten Expansion
der hematopoietischen Zellen zu bewirken . Stromale Zellen wurden in Membran-separierter
Co-Kultur mit hematopoietischen Zellen kultiviert . Kleine, 1 pm große Poren erlaubten zwar
den Austausch von Nähr- und Botenstoffen zwischen den beiden Kammern des zu diesem
Zweck entwickelten Bioreaktors, hielten jedoch den Zellkörper der Stromalen Zellen zurück,
sodass es nicht zu einer Vermischung der beiden Zelltypen kam und die hematopoietischen
Zellen separat gewonnen werden konnten . Im Mittel konnten mononukleäre Zellen über einen
Kultivierungszeitraum von 7 Tagen um Faktor 61, Vorläuferzellen und frühe Vorläuferzellen
jeweils um Faktor 22 bzw. 19 expandiert werden. Der Entwicklung des Bioreaktors im
klinischen Maßstab ging die Erprobung und Optimierung des Ansatzes in einem miniaturisierten
Testsystem voraus.
Hematopoiesis is a highly regulated process. A large variety of signaling factors, cell
surface receptors and extracellular matrix molecules influence and direct cell expansion,
maturation, differentiation, and apoptosis . Up to date, this complex network
could not be clarified in detail, making it impossible to establish natural hematopoiesis
for potential medical use in vitro. Despite this imprecise understanding, what is
known, is the important role that bone marrow stromal cells play in aforementioned
processes. In this work, the regulatory role of stromal cells during the expansion of
hematopoietic stem and progenitor cells, isolated from cord blood, was analysed and
finally exploited in order to improve biotechnological processes as for example the
large scale expansion of cells . At first, optimal conditions for the production of
stroma-conditioned media were established . Thereafter, differences between media,
gained from three murine stromal cell lines, were analysed on single protein level .
One protein, which could be isolated and identified, turned out to mimick the medium's
effect on hematopoietic cells. Second, a novel bioreactor system, based on
membrane-separated co-cultivation of murine stromal cells and human hematopoietic
stem and progenitor cells, was developed . This special arrangement allows for the
exchange of signaling molecules and nutrients through small pores in the membrane,
whereas the harvest of stem cells can be performed without contaminating murine
stromal cells. After 7 days of cultivation, mononuclear cells, progenitor cells and early
progenitor cells could be expanded on average 61-fold, 22-fold and 19-fold, respectively
. A small scale test system served for the analysis and further development of a
clinical scale bioreactor.
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