Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4101
Krings, Eva
Genomweite Effekte des Transkriptionsregulators LysG in Corynebacterium glutamicum
IV, 119 S., 2003
Es
ist
bekannt,
dass
bei
der
L-Lysinproduktion
mit
C. glutamicum
die
Art
der
Kohlenstoffquelle einen Einfluß auf die L-Lysinbildung hat. Die Regulation der L-Lysinausscheidung
in C. glutamicum erfolgt auf genetischer Ebene durch den Transkriptionsregulator
LysG, welcher in Verbindung mit dem Induktor L-Lysin die Expression des
L-Lysinexportcarriergens IysE induziert. Eine mögliche Verknüpfung zwischen der Regulation
des L-Lysinexports und dem Zuckerstoffwechsel war unbekannt. Es war deswegen das Ziel
dieser Arbeit zu untersuchen ob LysG über die Kontrolle von IysE hinaus möglicherweise mit
dem Zuckerstoffwechsel interagiert.
- Um LysG-bindende DNA-Fragmente aus dem Genom von C. glutamicum zu isolieren,
wurden Titrationsanalysen mit dem Indikatorstamm R127ppc::pEM3 dppcGE"lacZ
durchgeführt . Auf diese Weise konnten von etwa 13 600 Klonen ausgehend 11 Klone
identifiziert werden, deren verringerte lacZ-Expression auf LysG-Bindung schließen ließ .
Zur weiteren Einengung der LysG-bindenden Bereiche wurden anschließend
10 Promotoren
der
sequenzierten
DNA-Bereiche
ausgewählt
und
erneut
auf
LysG-Bindung geprüft . Auf diese Weise gelang es, einen Transposon-Promotor
(tnp1513pl ), sowie einen Promotor der Purinbiosynthese (purMpl) zu identifizieren, an
dem LysG bindet .
- Parallel zu diesem lacZ-Ansatz, wurden DNA-Chip Analysen bei Wachstum auf
Komplexmedium durchgeführt . Aus mehreren unabhängigen Experimenten ergab sich,
dass bei lysG-Überexpression ein Cluster von 10 Genen etwa 3- bis 5-fach stärker
exprimiert wurde als im Wildtyp . Dieses Cluster enthielt unter anderem putative Gene für
den ABC-Transport von Maltose. Ein weiteres Cluster von 4 Genen wird 2 bis 3-fach
verringert exprimiert . Dieses Cluster enthält putative Gene des Stoffwechsels von
myo-Inositol, einem Zuckeralkohol, der ebenso wie Glukose und Maltose von
C. glutamicum als Energie- und Kohlenstoffquelle verwertet werden kann .
- Wie DNA-Chip Analysen bei Wachstum in Minimalmedium zeigten, ist der beobachtete
Einfluß von LysG auf die putativen Gene des Maltosetransports von LysG allein und nicht
von LysG in Verbindung mit der zellinternen L-Lysinkonzentration abhängig . Durch die
Charakterisierung einer ma/GFE-Deletionsmutante sowie DNA-Chip Analysen bei
Wachstum auf Maltose konnte ausgeschlossen werden, dass die Gene ORF1242,
ORF1243 und ORF1245 direkt am Maltosestoffwechsel beteiligt sind.
- Die Untersuchungen zur spezifischen Genexpression bei Wachstum auf myo-Inositol
zeigten dagegen, dass in C. glutamicum zwei Iol-Operons (Iol-Operon I : ORF555-
ORF3542; Iol-Operon 11 : ORF3430-ORF3442) existieren, deren Gene zur Verwertung des
Zuckeralkohols nötig sind . Unter den insgesamt 21 Genen zeigen allein 4 Gene hohe
Ähnlichkeiten zu myo-Inositoldehydrogenasen . Nur deren gemeinsame Deletion
resultierte im Verlust der Mutanten auf dem Hexitol zu wachsen .
- Wie die Charkterisierung einer ioID-Deletionsmutante zeigte, ist ioID (ORF560) für den
myo-Inositolstoffwechsel in C. glutamicum essentiell . Darüberhinaus wirkt sich die
Deletion von ioID positiv auf die Bildung von L-Lysin aus. Da die ioID-Deletionsmutante
außerdem schlechter auf Glukose als alleiniger Kohlenstoffquelle wächst als der Wildtyp,
ist ein Zusammenhang zwischen der Verwertung der Kohlenhydrate Glukose und myo-
Inositol einerseits und der Produktbildung andererseits anzunehmen .
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