Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4048
Köngeter, Astrid
Genetische Inaktivierung des Hyperpolarisations-aktivierten Ionenkanals HCN4
VIII, 115 S., 2003
In der vorliegenden Arbeit wurden Maus Knockout-Modelle zur genetischen Inaktivierung
des hyperpolarisations-aktivierten Ionenkanal HCN4 entwickelt. Die HCN4-Kanal-
Untereinheit wird unter anderem im Herzen exprimiert und ist vermutlich an der
Rhythmogenese des Herzschlags beteiligt. Eine Maus mit einem konventionellen Knockout,
bei dem die Kanal-Untereinheit im gesamten Organismus ausgeschaltet wird, wäre deshalb
möglicherweise nicht lebensfähig. Deshalb wurde ein neben einem konventionellen Knockout
auch ein Knockout-Modell entwickelt; in dem der Knockout selektiv (konditionell)
herbeigeführt werden kann. Zur Herstellung des konditionellen Knockout soll das Cre/loxP Rekombinase
System verwendet werden. Um die Klonierung der Targeting-Vektoren zu
ermöglichen, wurde zunächst die genomische Struktur des HCN4-Lokus der Maus geklärt.
Der HCN4-Lokus ist 35 kBp groß und befmdet sich auf Chromosom 9. Der Lokus besteht aus
acht Exonen. Anhand der Sequenz-Information wurden die Targeting-Vektoren für einen
konventionellen und konditionellen Knockout der HCN4-Kanal-Untereinheit kloniert. Die
Targeting-Vektoren wurden durch Elektroporation in embryonale Stammzellen eingebracht.
Positive ES-Zell-Klone wurden mittels Antibiotika-Resistenz selektioniert. Konventioneller
Knockout: Die DNA der Antibiotika-resistenten ES-Zell-Klone wurde mittels radioaktiver
Sonden im Southemblot analysiert. Durch diese Analyse wurde geprüft, ob der Targeting-
Vektor gerichtet in den HCN4-Lokus des Maus-Genoms integriert wurde. Es konnten zwei
ES-Zellklone identifiziert werden, deren HCN4-Lokus in der gewünschten Form verändert
war. Einer dieser Klone wurde in Maus-Blastozysten injiziert und diese in scheinschwangere
Mäuse implantiert. Es wurden Chimären (+/-) geboren. Diese Chimären sind lebensfähig und
phenotypisch nicht auffällig. Die Chimären wurden mit Wildtyp Mäusen gepaart. Die
Nachkommen dieser Mäuse waren bei Abschluß dieser Arbeit noch nicht geboren. Sie wären
für den mutierten HCN4-Lokus "rein" heterozygot (+/-) und müssten miteinander verpaart
werden, um homozygote Mäuse (-/-) zu erhalten. Konditioneller Knockout: Die Analyse der
ES-Zell-Klone konnte im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden. Über
die Auswirkungen eines HCN4 Knockout (-/-) kann im Moment nur spekuliert werden. Die
Erzeugung rhythmischer Aktivität im Thalamus und im Sinusknoten des Herzens wird durch
HCN-Ströme kontrolliert. In beiden Geweben wird neben anderen HCN-Kanal-
Untereinheiten die HCN4-Kanal-Untereinheit exprimiert. Besonders im Thalamus scheinen
die HCN-Ströme durch die HCN4-Kanal-Untereinheit dominiert zu werden. Deshalb sind bei
einer HCN4 Knockout Maus massive Auswirkungen auf die Erzeugung rhythmischer
Aktivität zu erwarten.
The present work describes the development of knockout models for the genetic inactivation
of the hyperpolarization-activated channel HCN4. The HCN4-subunit is expressed in the
sinoatrial node of the heart, where it is probably involved in the generation of cardiac
pacemaking. As a consequence, HCN4-deficient mice (conventional knockout), might be
lethal. Therefore, in addition to the conventional knockout model, a conditional knockout
modei was developed. A conditional knockout provides the possibility to inactivate the gene
in a selected tissue or at a selected developmental stage. The Cre/loxP-based strategy was
used to generate the conditional knockout model. As a prerequisite for the design of the
targeting vectors the genomic structure of the mouse HCN4 gene was identified. The HCN4
gene is about 35 kbp and is located on chromosome 9. The locus contains eight exons. This
information allowed to design targeting vectors for both conventional and conditional
knockout of the HCN4-channel-subunit. These targeting vectors were transferred to
embryonic stem cells (ES cells) by electroporation. Positive clones were selected for their
antibiotics resistance. Conventional knockout: the DNA of the antibiotics resistent ES cell
clones was analysed by southemblotting. In two of these clones, the vector was integrated in
the HCN4 gene in the correct orientation. These clones were implantated into blastocysts,
which were injected into pseudo-pregnant mice. Chimeras (+/-) were born that showed a
normal phenotype. They were bred with wildtype mice to get pure heterozygote mice. By the
time this thesis was submitted, the heterozygote mice had not been born. The heterozygote
mice will have to be bred to get homozygote HCN4-deficient (-/-) mice. Conditional
knockout: The analysis of the ES cell clones has not been completed yet. At present we can
oniv speculate about the effict of the genetic inactivation of the HCN4-channel. The
regulation of rhythmic activity in the thalamus and in the sinoatrial node of the heart is
regulated by HCN-channels. In both tissues HCN4 is expressed together with other HCN subunits.
Especially in the thalamus, HCN-currents seem to be dominated by the HCN4-
subunit. Thus in HCN4-deficient mice a strong disturbance in the generation of rhythmic
activities is to be exspected.
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