Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-4032
Niebisch, Axel
Molekulare Charakterisierung des Cytochrom -bc1-aa3-Superkomplexes aus Corynebacterium glutamicum
IV, 106 S., 2003

Spektroskopische Untersuchungen und Inhibitorstudien deuteten auf eine verzweigte Atmungskette in Corynebacterium glutamicum hin, bei der der Elektronenfluß von Menachinol auf Sauerstoff entweder über einen Cytochrom-bcl-Komplex und eine Cytochrom-c-Oxidase des aa₃-Typs oder alternativ über eine Menachinoloxidase des bd-Typs verlaufen kann. Diese Arbeit hatte eine molekulare Charakterisierung des postulierten bc_l-aa₃-Zweigs zum Ziel.

1. Die Gene der drei Untereinheiten des bcl-Komplexes (gcrCAB) sowie der Untereinheiten I und III der Cytochrom-aa₃-Oxidase (ctaD und ctaE) wurden kloniert und sequenziert . Eine Analyse der abgeleiteten Proteinsequenzen zeigte eine Reihe außergewöhnlicher Merkmale: Das Rieske-Eisen-Schwefel-Protein (QcrA) enthielt drei putative N-terminale Transmembranhelices und Cytochrom b (QcrB) besaß zusätzlich zum konservierten Teil eine große C-terminale Domäne aus etwa 130 Aminosäuren . Besonders bemerkenswert war, daß Cytochrom c_l (QcrC) zwei CXXCH-Motive für die kovalente Bindung von Hämgruppen enthielt, was andeutete, daß dieses Protein ein Dihäm-Cytochrom c ist.
2. Die Inaktivierung des bc_l-Komplexes bzw. der Cytochrom-aa3-Oxidase durch chromosomale Deletion der qcr-Gene bzw. des ctaD-Gens hatte eine starke Hemmung des aeroben Wachstums auf Glucose-Minimalmedium im Vergleich zum Wildtypstamm ATCC13032 zur Folge. Dies zeigt, daß der bc_l-aa₃-Weg der Hauptweg der Atmung unter diesen Bedingungen ist.
3. Cytochrom b (QcrB) bzw. die Untereinheit I der Cytochrom-aa₃-Oxidase (CtaD) wurden mit einem C-terminalen StrepTag II verlängert und über Affmitätschromatographie an StrepTactin-Sepharose gereinigt . In beiden Fällen wurde ein bc_l-aa₃-Superkomplex gereinigt, der eine Chinoloxidase-Aktivität besaß und somit eine funktionelle Assoziation von bc_l-Komplex und Cytochrom-aa₃-Oxidase darstellte.
4. Mutation der Cysteine in jeweils einem der Hämbindemotive von Cytochrom c_l (QcrC) führte zu einem ähnlichen Phänotyp wie nach Deletion der qcr-Gene. In den Membranen der beiden Stämme war kein c-Typ-Cytochrom nachweisbar und der QcrB-Gehalt drastisch reduziert . Beide Hämbindemotive in QcrC sind offenbar essentiell für Aktivität, Assemblierung und/oder Stabilität des bc_l-Komplexes .

Spectroscopical investigations and inhibitor studies indicated a branched respiratory chain in Corynebacterium glutamicum. Electrons can be transferred to oxygen either via a cytochrome bcl complex and a aa₃-type cytochrome c oxidase or alternatively via a menaquinol oxidase of the cytochrome bd-type. The aim of this work was a molecular characterization of the postulated bc_l-aa₃-branch . The genes of the three subunits of the bc_l complex (gcrCAB) and of subunits I and III of cytochrome aa3 oxidase (ctaD and ctaE) were cloned and sequenced . Analysis of the deduced protein sequences showed a number of unusual features. The Rieske iron sulfur protein (QcrA) had three putative N-terminal transmembranhelices and cytochrome b (QcrB) possessed a large C-terminal domain consisting of approximately 130 amino acids in addition to the conserved part ofthe protein. Most remarkably, cytochrome c_l (QcrC) contained two CXXCH motifs for covalent heme binding indicating that this protein is a diheme- cytochrome c. Inactivation of the bc_l complex or the cytochrome aa₃ oxidase by chromosomal deletion of the qcr genes and the ctaD gene, respectively, led to strongly impaired aerobic growth an glucose minimal medium indicating that the bc_l-aa₃-pathway is the main route of respiratoon under these conditions. Cytochrome b (QcrB) and subunit I of cytochrome aa₃ oxidase (CtaD) were elongated with a C-terminal StrepTag II and purified by affmity chromatography an StrepTactin sepharose. In both cases a bc_l-aa₃-supercomplex was obtained which possessed quinol oxidase activity and therefore represented a functional association of bc_l complex and cytochrome aa₃ oxidase. Mutation of the cysteine residues in either heme binding motifs of cytochrome c_l (QcrC) led to a similar phenotype like deletion of the qcr genes. No c-type cytochrome could be detected in membranes of both strains and their QcrB content was strongly reduced. Obviously both heme binding motifs of QcrC are essential for activity, assembly and/or stability ofthe bc_l complex.

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