Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4002
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden 12 verschiedene putative OR durch RT-PCR in
Keimzellen von männlichen Mäusen identifiziert. Vier OR wurden vollständig kloniert. Die
12 OR stammen aus 10 verschiedenen Subfamilien . Dies bedeutet, daß die im Hoden
exprimierten OR keine eigene Subfamilie von hodenspezifischen OR bilden. Mit Ausnahme
von TOR8, der zur Klasse I (Fisch-ähnliche) der OR zu rechnen ist, gehören die anderen OR
der Klasse II (Säugetier-ähnliche) an. Alle untersuchten OR sind auch in Riechzellen
exprimiert . 6 OR sind darüber hinaus auch in verschiedenen weiteren Geweben (z.B . Gehirn,
Herz) nachweisbar. Für die meisten der untersuchten OR konnten Transkripte bereits im
präpubertären Hoden nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, daß OR nicht nur eine
Funktion in reifen Spermien haben könnten, sondern bereits während der Entwicklung bzw.
der Organisation des Keimzellepithels .
Durch Northernblot-Experimente konnte nachgewiesen werden, daß zwei OR, TOR13
und TORSI, höher exprimiert sind als die anderen OR Transkripte von TOR13 konnten
durch in situ Hybridisierung in Spermatogonien und Spermatozyten lokalisiert werden. Die
Klonierung von TOR13 und TORSI zeigte, daß es sich bei TOR13 um einen C-terminal
verkürzten OR handelt. Es ist unbekannt, ob ein OR, dem die 7 . transmembranale Domäne
und der C-Terminus fehlen, funktionell ist. Aus diesem Grund wurde nur TORSI
charakterisiert . Eine Southernblot-Analyse von genomischer DNA zeigte, daß TORSI das
einzige Gen einer neuen Subfamilie darstellt. TORS 1 ist auf Chromosom 11 lokalisiert . Das
TORS1-Gen ließ sich nicht fimktionell heterolog exprimieren, obwohl das Rezeptorprotein in
den Wirtszellen synthetisiert und auch posttranslational modifiziert wurde. Mit TORS 1
konnte ein OR-Gen identifiziert werden, das für einen konditionalen Gen knock-out geeignet
wäre . Mit einem Gen knock-out könnte man vielleicht Hinweise auf die physiologische
Funktion der OR in Spermien erhalten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Gaolf, der Wechselwirkungspartner von OR in
Riechzellen, aus Hoden-cDNA kloniert. Durch Westemblot-Experimente konnte Gαolf in
Spermien detektiert werden. Immunhistochemische-Versuche zeigten, daß Gαolf im
akrosomalen Bereich der Spermien lokalisiert ist. Die Adenylylzyklase III, der Effektor von
Golf in Riechzellen, ließ sich durch Westernblot-Analyse nicht in Spermien nachweisen. Dies
bedeutet, daß OR in Spermien nicht, wie in Riechzellen, über Gaolf die ACIII aktivieren
können. Die OR müssen in Spermien einen anderen Signalweg aktivieren.
Im dritten Teil wurde schließlich untersucht, ob eine membranständige Rezeptor-
Guanylylzyklase und ein cGMP-gesteuerter Ionenkanal (CNG-Kanal) in Maus-Spermien
exprimiert sind. Eine cGMP-vermittelte Signalkaskade könnte - ähnlich wie in
Seeigelspermien - das chemotaktische Verhalten regulieren. Mit Hilfe von RT-PCR konnten
aus Keimzellen-cDNA Transkripte der Guanylylzyklase-D amplifiziert werden. Ebenfalls
konnten Transkripte der (x-Untereinheit mCNGA3 und der modulatorischen β-Untereinheit
mCNGB3 nachgewiesen werden. In immunhistochemischen Experimenten wurde die GC-D
in den Flagellen der Spermien lokalisiert. Die GC-D und der CNG-Kanal könnten
Bestandteile eines cGMP-Signalwegs sein, der das Schwimmverhalten von Säugetier-
Spermien reguliert.
In the ferst part of this PhD Thesis, 12 different putative OR have been identified by
RT-PCR in germ cells of male mice. Four complete OR genes were cloned from genomic
DNA. The twelve amplified ORs are members of ten subfamilies revealing that testicular ORs
do not constitute a specific subfamily. Except for TOR8 that belongs to class I OR (fish-like),
the other receptors are members of class II OR (mammalian-like) . All ORs are also expressed
in OSN. Furthermore 6 ORs are expressed in additional tissues (i.e. heart, brain). Most ORs
are already expressed in the prepubertal testis. This finding points out that - in addition to a
functional role in mature sperm - ORs may be involved in the development and organization
of the germ cell epithelium.
Northemblot experiments revealed that two ORs (TOR13 and TORSI) are more
abundantly expressed than the other ORs. By in situ hybridization-experiments transcripts of
TOR13 were localized to spermatogonia and spermatocytes. Cloning of the TOR13 and
TORSI genes showed that the TOR 13 gene codes for a C-terminal truncated receptor protein .
Because it is unknown whether an OR lackeng the seventh transmembrane domain and the Cterminus
is functional, only the TORS 1 gene was further characterized. Southemblot analysis
revealed that TORSI is the only gene of a new cluster. The gene could be assigned to
chromosome 11 . TORS1 could not be functionally expressed in a heterologous system
although the receptor protein was synthesized and posttranslationally modified in the host
cells. In conclusion, TORSI is a candidate for a conditional gene knock-out. This approach
might provide a deeper insight into the function of ORs in sperm cells.
In the second part, Gaolf, the interaction partner of OR in OSN, has been cloned from
testicular cDNA. By Westemblot experiments, Gαolf could be detected in sperm. Gαolf was
immunhistochemically localized to the acrosomal part of the head. Adenylyl cyclase III
(ACIII), the effector of Golf in OSN, could not be detected in sperm by Westemblot
experiments . Thus unlike in OSN, OR in sperm do not activate ACIII by means of Gaolf.
Consequently, in sperm ORs must participate in a different signaling cascade.
In the third part, I investigated whether a receptor GC and a cGMP-regulated ion
channel (CNG-channel) are expressed in sperm. A signaling cascade comprising a receptor
GC could be involved in chemotaxis such as in sea urchin sperm. Transcripts of the GC-D
could be identified in cDNA of sperm precursor cells. The ion channel a-subunit mCNGA3
und the modulatory β-subunit mCNGB3 have been also amplified from germ cell cDNA. In
immunhistochemical experiments, the GC-D was localized to the principal piece of the sperm
tail. Thus, it is tempting to speculate that the GC-D and the CNG ion channel are components
of a signaling pathway that regulates the swimming behaviour ofmammalian sperm cells .
Meurer, Steffen Klaus
Molekularbiologische und immunologische Charakterisierung von Chemorezeptoren in Säugetier-Spermien
IX, 137 S., 2003
Die Chemotaxis von Invertebraten-Spermien ist gut dokumentiert (Morisawa, 1994). Das
chemotaktisch wirkende Eizellpeptid Resact der Seeigelart Arbacia punctulata bindet an eine
membranständige Rezeptor-Guanylylzyklase (Ward et al., 1985; Shimomura et al., 1986).
Säugetier-Spermien reagieren chemotaktisch auf Substanzen, die von der Eizelle selbst
und/oder vom weiblichen Genitaltrakt stammen (Eisenbach & Tur-Kaspa, 1999). Bislang
konnten jedoch weder die chemotaktisch wirksamen Substanzen noch die entsprechenden
membranständigen Rezeptoren identifiziert werden. Derzeitige Hypothesen über die
chemotaktische Signalkette orientieren sich an den Signalwegen zur Wahrnehmung von
Duftstoffen in Riechzellen. Demnach könnten Duftstoffrezeptoren (OR) oder die
membranständige Guanylylzyklase-D eine Rolle bei der Chemotaxis von Säugetier-Spermien
spielen.
Chemotaxis of sperm is well established in marine invertebrates, such as sea urchin
(Morisawa, 1994). The chemotactic egg-derived peptide resact of the sea urchin Arbacia
punctulata binds to a membrane-bound receptor-guanylyl cyclase. Mammalian sperm Show
chemotactic behaviour in response to factors released by the egg itself and/or the female
reproductive tract. Neither the chemotactic factors nor the respective membrane receptors of
sperm have been identified. Current hypotheses an the chemotactic signaling pathways rely
an models for odorant sensation in olfactory sensory neurons (OSN). Thus, G-protein coupled
odorant receptors (OR) or the receptor guanylyl cyclase-D might play a role in chemotaxis of
mammalian sperm.
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