Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3938
Hilbert, Ulrike
Ex vivo Expansion von humanen CMV spezifischen T-Lymphozyten im Bioreaktor
I, 184, LIII S., 2002
Die ex vivo Vermehrung von humanen T-Lymphozyten gewinnt in der medizinischen
Anwendung immer mehr an Bedeutung. Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die adoptive
Immuntherapie zur Bekämpfung viraler Infektionen und Tumoren bei Patienten, deren
Immunsystem durch Krankheit oder Behandlung geschwächt ist. Neben der Produktion der
für eine Therapie benötigten Zellmengen (bis 109 spezifische Zellen) ist die Erhaltung der
Teilungsfähigkeit und der biologischen Aktivität von kultivierten und expandierten T-Lymphozyten nach Transfusion von zentraler Bedeutung.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens für die Generierung
spezifischer T-Lymphozyten. Als biologisches Modell wurde, ausgehend von mononukleären
Zellen aus peripherem Blut, die Generierung von Zytomegalievirus spezifischen
T-Lymphozyten angestrebt.
Es erfolgte eine in vitro Charakterisierung von Immunzellen. Neben der ausführlichen
Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie wurde die
Effektorfunktion der Immunzellen untersucht. Dabei wurde ein Zytotoxizitätstest, gegen
spezielle Zelllinien (K562, Raji und T2 Zelle), basierend auf der Freisetzung von Europium,
etabliert und optimiert. Weiterhin wurde die Effektorfunktion dieser Zellen über IFN-[gamma]
bestimmt. Hierzu wurde ein Test zur intrazellulären Detektion von IFN-[gamma] optimiert und ein
IFN-[gamma] Sekretionstest eingesetzt.
Beim Einsatz von stimulierenden Faktoren ([alpha]CD3 mAb, [alpha]CD28 mAb und IL-2) konnte eine
polyklonale unspezifische Aktivierung und Proliferation von PBMCs erzielt werden. Nach der
Untersuchung von verfahrenstechnischen Parametern (Zelldichte, Temperatur,
Fütterungsstrategie, Osmolalität, pH-Wert, pO2-Wert und IL-2 Verbrauch) konnte unter
kontrollierten Prozessbedingungen in einem Suspensionsreaktor und anschließend in einem
20 L Rührkessel die Kultivierung im für Primärzellen großen Maßstab realisiert werden.
Dabei wurde eine Gesamtzellzahl von 3·1010 Zellen mit einem Anteil von > 90% T-Lymphozyten erreicht. Weiterhin zeigten vergleichende Untersuchungen von unspezifischen
T-Lymphozyten in Gewebekulturflaschen und Suspensionsreaktor einen Erhalt von HCMV
spezifischen T-Lymphozyten nach 14tägiger Kultivierung.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Protokoll zur Generierung von Dendriten aus peripherem
Blut etabliert werden. Hierzu wurden adhärente PBMCs nach Plastikadhäsion mit
zytokinhaltigem Medium (GM-CSF, IL-4 und TNF-[alpha]) für 9 Tage kultiviert. Die so erhaltenen
Zellen exprimierten charakteristische Dendritenmarker und zeigten mit einem sternförmigen
Zellkörper und Zellausläufern die dendritentypische Morphologie.
In statischen Gewebekultursystemen wurden die Parameter für eine spezifische Stimulation
über antigenpräsentierende Zellen zur Generierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten
optimiert. Als Antigen wurde im Rahmen dieser Arbeit das Matrix Struktur HCMV pp65495-
503 Peptid und das HCMV AD 169 Strain Protein aus Vorhaut Fibroblasten eingesetzt. Dabei
wurde die Pulszeit der APCs mit Antigen, die Wahl der APCs, die Zelldichte, das
Zellzahlverhältnis zwischen APC und T-Zellen, der Einsatz von serumhaltigem Medium, die
IL-2 Zugabe, die Ausgangspopulation und die Restimulation untersucht. Mit diesen
optimierten Stimulationsparametern wurde eine selektive Generierung von HCMV
spezifischen T-Lymphozyten ermöglicht. Nach einer 1 bis 2wöchigen Vorkultur in statischen
Kultursystemen konnte anschließend im Suspensionsreaktor eine Kultivierung unter
kontrollierten Bedingungen realisiert werden. Nach wöchentlicher spezifischer Restimulation
stieg der Anteil der IFN-[ha,,a]+-T-Lymphozyten wöchentlich um einen Faktor von 3. Mit einem
Anteil von 23,4% am 28. Tag der Kultivierung konnten somit 7,5·107 HCMV spezifische T-
Lymphozyten im Reaktor generiert werden. Es wurden Rahmenbedingungen zur Generierung
spezifischer T Lymphozyten entwickelt, die eine Umsetzung in den klinisch relevanten
Maßstab ermöglichen.
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