Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3945
Die Fourier-Transform Infrarot (FTIR)-Spektroskopie an BR mit polarisiertem Messlicht liefert mit dem zeitaufgelösten Lineardichroismus einen zusätzlichen Parameter zur Beschreibung der Strukturänderungen während des Photozyklus. Lineardichroismus-Messungen werden einerseits zu einer verbesserten Auftrennung der Intermediatspektren genutzt, andererseits ermöglichen sie die Bestimmung der Orientierung von Übergangsdipolmomenten bzw. zugeordneter Bindungsstrukturen. Darüber hinaus können in Röntgenstrukturen nicht sichtbare transiente Protonierungen von Aminosäureseitenketten, die bei einer Protonenpumpe einen entscheidenden Teil des Funktionsmechanismus ausmachen, auf diese Weise verfolgt werden.
Im Vergleich zu BR ist über den Photozyklus der Chloridpumpe Halorhodopsin deutlich weniger bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wird der Einfluss der Chloridkonzentration auf die Kinetik mittels zeitauflösender FTIR-Spektroskopie untersucht. Die Verwendung der attenuated total reflection (ATR)-Technik, hier mit einer neuartigen Diamant-ATR-Zelle, ermöglicht die reproduzierbare Einstellung von Salzkonzentrationen bei Infrarotmessungen von 0 bis 5 mol/l. Der entsprechende Einfluss auf die Entstehung und den Zerfall von Intermediaten erlaubt die Formulierung eines alternativen Photozyklusmodells.
Resonanz-Raman-Messungen an beiden Proteinen liefern ergänzende Informationen zur Zuordnung der Schwingungsbanden und demonstrieren die Möglichkeiten der Apparatur als Mikro-Raman-Spektrometer bei der Untersuchung von Proteinkristallen.
Fourier-Transform Infrared (FTIR)-spectroscopy on BR with polarized measuring light presents an additional parameter, the linear dichroism, to track the structural changes during the photocycle. These measurements are used not only for improved separation of the photocycle intermediates, but also to calculate orientations of transition dipole moments and thereby of structural elements. In addition, it is possible to resolve transient protonations of amino acid side chains, an important part of the mechanism of a proton pump and also invisible with the x-ray technique.
In contrast to BR not much is known about the photocycle of the chloride pump HR. In this work, the influence of the chloride concentration on the kinetics is investigated with time-resolving FTIR-spectroscopy. The use of the attenuated total reflection (ATR)-technique, here with a new diamond ATR cell, allows reproducible adjustment of the salt concentration in infrared experiments in the range between 0 to 5 mol/L. An alternative photocycle model has been formulated based on the respective influence on the formation and decay of the intermediates.
Resonance Raman measurements on both proteins give additional information on the assignment of vibrational modes and demonstrate the potential of the spectroscopic setup as a micro-Raman-spectrometer for the investigation of protein crystals.
Bolwien, Carsten
Zeitauflösende Schwingungsspektroskopie an Bacteriorhodopsin und Halorhodopsin
II, 125 S., 2002
Die Proteine Bacteriorhodopsin (BR) und Halorhodopsin (HR) finden sich in der Zellmembran des salzliebenden Archaebakteriums Halobacterium salinarum. BR ermöglicht unter extremen Bedingungen als lichtgetriebene Protonenpumpe einen zur Atmungskette alternativen Weg der Herstellung eines Protonengradienten. HR dient als lichtgetriebene Chloridpumpe der Aufrechterhaltung der Salzkonzentration im Inneren der Zelle bei wechselnden Bedingungen. Die von beiden Proteinen bekannten Röntgenstrukturen - im Fall von BR sind darüber hinaus Strukturen einiger Photozyklusintermediate bekannt - bilden eine wichtige Grundlage zum Verständnis des jeweiligen Funktionsmechanismus. Sie können aber die Dynamik der Prozesse während des Photozyklus nicht abbilden. Diese Lücke schließt die zeitauflösende Schwingungsspektroskopie, die in der Lage ist, transiente Änderungen in der Struktur der Proteine zu detektieren.
The proteins Bacteriorhodopsin (BR) and Halorhodopsin (HR) can be found in the cell membrane of the halophilic archaebacterium Halobacterium salinarum. Under extreme circumstances, BR as a light-driven proton pump provides an alternative to the respiratory chain in order to establish a proton gradient. HR as a light-driven chloride pump is used to maintain the chloride concentration in the cytoplasm under varying conditions. The previously published ground state x-ray structures of both proteins - in the case of BR additional structures of photocycle intermediates are known - form an important basis for the understanding of the functional mechanism, although they fail to provide a dynamic picture of the process. However, this picture is provided by time-resolving vibrational spectroscopy, which is able to detect transient changes in the structure of the proteins.
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