Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3934
Fastermann, Dirk
Halorhodopsin - Klonierung, Expression, Kristallisation und spektroskopische Untersuchungen zum Mechanismus dieser Anionenpumpe
III, 111 S., 2001
In Halobacterium salinarum wurden bisher 4 Retinalproteine gefunden. Die Ionenpumpen
Bakteriorhodopsin (BR) und Halorhodopsin (HR) sowie die phototaktischen Proteine
Sensouhodopsin I (SRI) und Sensouhodopsin II (SRII). Gegenstand dieser Arbeit waren
funktionelle Untersuchungen der Anionenpumpe HR, wobei der Schwerpunkt auf der Analyse
des Mechanismus des lichtgetriebenen Anionentransportes lag.
Zunächst wurde das HR-Gen mit dem Promotor von BR verknüpft. Die Überexpression
erfolgte in dem BR-negativen H. salinarum Stamm L33. Dabei wurde die Expression durch
den BR-Promotor so verstärkt, dass HR in vivo zweidimensional kristallisierte. Zudem konnte
HR durch diese Anordnung in den Membranfragmenten sehr einfach im membrangebundenen
Zustand erhalten werden. Um das Protein zur Kristallisation und für spektroskopische
Untersuchungen einzusetzen, wurde eine schonende Reinigungsmethode etabliert.
Kristallisationsversuche mit dem solubilisierten Membranprotein mittels Dampfdiffusion und
kubischer Lipidphase wurden durchgeführt. Mit der kubischen Lipidphase konnten
dreidimensionale Kristalle erhalten werden, die allerdings keine Diffraktion zeigten.
Um die Chloridabhängigkeit des HR-Photozyklus zu untersuchen, erfolgte zunächst eine
statische Chloridtitration von HR-Membranen. In den Absorptionsdifferenzspektren konnten
drei verschiedene Zustände (bei 540 nm, 580 nm und 650 nm) mit in Abhängigkeit der
Chloridkonzentration variierenden Absorptionsmaxima nachgewiesen werden. Der
chloridabhängige Verlauf der Zustände lässt auf drei Bindungskonstanten für HR schließen.
Zeitaufgelöste Messungen im sichtbaren Spektralbereich führten zur Erstellung eines
chloridfreien (Intermediate: HR540 und HR-K650) und eines chloridhaltigen Photozyklus
(Intermediate: HR580, HR-K650 und HR-L520). Dabei wird der chloridfreie Photozyklus
wesentlich schneller durchlaufen als der chloridhaltige. Mit Hilfe der zeitaufgelösten Fr -IR-
Spektroskopie in Kombination mit der ATR-Technik wurde die Chloridabhängigkeit
untersucht. Es konnte mit steigender Chloridkonzentration eine Beschleunigung der
Entstehung des HR-L-Intermediates festgestellt werden. Der Zerfall des L-Intermediates
verlangsamt sich hingegen mit steigender Chloridkonzentration. Bei sehr hohen
Chloridkonzentrationen (5 M) konnten Unterschiede in der Amid I-Region zwischen frühen
HR-L-Differenzspektren und den HR-L-Differenzspektren zu späten Zeiten detektiert
werden. Dies lässt auf eine Strukturänderung des Proteinrückgrates schließen. Durch
Messungen des Lineardichroismus konnte diese Annahme bestätigt werden. Die Abhängigkeit
des Aufbaus des HR-L1- und des Zerfalls des HR-L2-Intermediates von der
Chloridkonzentration deuten auf eine Chlorid-Ionenaufnahme beim Übergang des HR-K-
Intermediates zum HR-L1-Intermediat und eine Chlorid-Ionenabgabe beim Übergang des
HR-L2-Intermediates in den Grundzustand hin.
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