Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3876
PAR-4 spielt als protagonistischer Faktor eine entscheidene Rolle bei der Vermittlung des
programmierten Zelltodes, sowohl in bestimmten Tumorzellen als auch in der Symptomatik
vieler neurodegenerativer Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson. PAR-4 scheint in
dieser apoptotischen Signalkaskade an einem sehr frühen Punkt aktiv zu sein.
In den bier vorgestellten Arbeiten wurde versucht, PAR-4 heterolog zu exprimieren und zu
kristallisieren. Erste Versuche scheiterten an der geringen Löslichkeit des Proteins, ein
Problem, das durch die Verwendung hoher Konzentrationen zweiwertiger Kationen
überwunden werden konnte. Durch Verwendung von Affinitätstags und chromatographischer
Reinigungsmethoden konnten für die Kristallisation ausreichende Ausbeuten an PAR-4
sowohl aus E.coli (10 mg/g Zellen) als auch aus S.cerevisiae (2 mg/g Zellen) gewonnen
werden. Die Funktionalität des Proteins wurde auf physiologischer Ebene durch einen
Kinasetest überprüft. Der Faltungszustand bzw. die Struktur des isolierten PAR-4 wurde
durch verschiedene biophysikalische Methoden wie NMR und FTIR-Spektroskopie
untersucht und vorläufig charakterisiert. Kristallisationsexperimente führten bisher nur zu
Kristallen, die nicht für eine röntgenkristallographische Analyse geeignet sind. Die
Experimente hierzu stehen allerdings erst am Anfang. Ziel der weiteren Arbeiten wird die
Ermittlung der dreidimensionalen Struktur von PAR-4 sein.
PAR-4 plays an essential role mediating the susceptibility of cells towards apoptosis, is active
in certain tumors and is a protagonist responsible for some symptoms of various
neurodegenerative diseases such as the Alzheimer's or Parkinson's. In the apoptotic signal
cascade PAR-4 seems to act at an early stage.
Eidhoff, Ulf Benno
Heterologe Expression, Kristallisation und Untersuchungen zur Struktur von Bos taurus beta-Arrestin and Rattus norvegicus PAR-4
VI, 132 S., 2001
ß-Arrestine sind essentielle Regulatoren G-Protein gekoppelter Rezeptoren. Sie vermitteln
sowohl die Signalterminierung als auch in Funktion eines Adaptennoleküles die
Internalisierung der Rezeptoren von der Plasmamembran über "Clathrin coated Pits".
In dieser Arbeit wurden zunächst Protokolle zur heterologen Expression von bovinern
ß-Arrestin 1 in S. cerevisiae und zur Reinigung des rekornbinanten Proteins entwickelt. Durch
molekularbiologische Methoden wurden dem ß-Arrestin C- und N-terminale Affinitätstags
angefügt. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie und führte zu Ausbeuten
von bis zu 2,7 mg ß-Arrestin / Gramm Hefezellen. Die Reinheit des Proteins konnte durch
Verwendung zweier verschiedener Affinitätstags und sequenzielle Reinigung optimiert
werden. Durch Mutagenese von vier Cysteinen gegen Serine wurde die Stabilität des
gereinigten Proteins gegen Oxidation verbessert. Ferner zeigte sich, daß der Einsatz hoher
Konzentrationen an Phosphationen die Stabilität des Proteins in Lösung signifikant erhöht.
Die Funktionalität des heterolog exprimierten ß-Arrestins wurde anhand von Bindungsstudien
mit Rhodopsin bestätigt. Unter Verwendung von K,N a- Tartrat als Fällungsmittel konnte
ß-Arrestin kristallisiert werden, wobei die geringe Stabilität und die fehlenden Diffraktions-
eigenschaften der bis zu 800 pm großen Kristalle zunächst die röntgenkristallographische
Analyse behinderte. Durch die Co-Kristallisation von ß-Arrestin mit Inositiolhexaphosphat
(IP6) als Ligand konnte die Diffraktionsqualität der Kristalle erheblich gesteigert werden. Es
zeigte sich, daß weder die Art und Position der Affinitätstags noch IP6 einen Einfluß auf den
Habitus der Kristalle respektive die Packung der Moleküle irn Kristall hat. Anhand mit
Sychrotronstrahlung gemessener Datensätze und der Methode des Molekularen Ersatzes der
bekannten Röntgenstruktur von visuellem Arrestin, wird derzeit die Molekülstruktur des
ß-Arrestin 1 bestimmt. Darüber hinaus wurde ß-Arrestin mit Quecksilber durch Co-
Kristallisation derivatisiert, wodurch die Strukturdeterminierung, von dem Arrestin-Modell
unabhängig, durch die Methode des isomorphen Ersatzes ermöglicht wird
Als erstes Ergebnis der röntgenkristallographischen Analyse konnte eine Bindestelle für IP6 in
der C-terminalen Kuppel des ß-Arrestinmoleküls identifiziert werden. Weitere, in der
Literatur postulierte Bindestellen für IP6 konnten dagegen nicht verifiziert werden. Ziel der
weiteren Arbeiten wird die Verbesserung der kristallographischen Auflösung der Kristalle
sowie die Co-Kristallisation von ß-Arrestin mit seinen Bindungspartnern sein.
ß-arrestins are essential regulators of G-Protein coupled receptors. In addition to tenninating
the signal cascade, they mediate the endocytosis of the receptors through "clathrin coated
pits." In this work the protocols for the heterologous expression and purification of bovine
ß-arrestin in S.cerevisiae are established. Through mutagenesis affinity tags were added to the
ß-arrestin gene. Affinity chromatography yielded up to 2.7 mg of protein per gram of cells.
The purity of the protein was optimized by usage of two different affinity tags (C- and N-
tenninus) and sequential purification. The stability against oxidation and the solubility of the
protein were significantly increased through the mutagenesis of four cysteine residues to
serines and the employment of high concentrations of phosphate.
The functionality of the heterologously expressed ß-arrestin was demonstrated by means of its
capacity to bind rhodopsin. Using tartrate as a precipitant, crystals of purified protein were
grown as large as 800 µm; however the low stability and poor diffraction hampered
crystallographic success. By co-crystallization of ß-arrestin with its ligand inositol-
hexaphosphate (IP6) the diffraction quality of the crystals was dramatically improved. Neither
the type nor the position of the affinity tag used had any significant influence on the
appearance of the crystals hence on the packing of the molecules. Crystallographic data sets
obtained using synchrotron radiation are currently being analyzed to solve the three-
dimensional structure of ß-arrestin by molecular replacement of the known structure of visual
arrestin. Furthennore co-crystallized heavy metal derivatives of ß-arrestin were perfonned,
thereby enabling structure-detennination independent of the arrestin-model by means of
isomorphous replacement.
A first result to emerge from this analysis was the mapping of the IP6-binding site to the C-
tenninal dome of the ß-arrestin molecule as previously proposed. Furthennore there was no
evidence in support of additional binding-sites for IP6 as postulated in the literature.
Further work will involve the improvement of the diffraction quality of the crystals,
the determination of the three-dimensional structure of ß-arrestin as well as attempts to
co-crystallize ß-arrestin together with other proteins which interact specifically with it.
With the experiments presented in this thesis attempts were made to heterologously express
and to crystallize PAR-4. First trials failed due to the low solubility of the protein, a problem
which was overcome with high concentrations of divalent cations. Using affinity tags and
chromatographic methods sufficient amount of highly purified protein, suitable for
crystallization were obtained from E.coli (10 mg/g cells) as well as from S.cerevisiae (2 mg/g
cells). Functionality of the protein on the physiologicallevel was tested with a kinase assay.
The structure of the isolated protein and its integrity was investigated and preliminarily
described by biophysical techniques such as NMR and FTIR-spectroscopy. Crystallization
attempt so far have yielded crystals unsuitable for crystallographic pursuits. These results
serve as groundwork towards the three dimensional structure of PAR-4.
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