Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3863
Jelinek, Nanni
Kultivierung hämatopoietischer Zellen - Kokultur im Festbettreaktor
X, 192 S., 2001
Die ex vivo Expansion hämatopoietischer Zellen ist eine bedeutende Technologie mit einem
breiten Spektrum klinischer Applikationen. In dieser Arbeit wurde als Kultivierungskonzept
die ex vivo Simulation des menschlichen Knochenmarks gewählt, die technisch durch die
Kokultur hämatopoietischer und stromaler Zellen im Festbettreaktor realisiert wurde. Dabei
werden die Zellen auf porösen Collagen- Trägem immobilisiert. Als Screeningsystem wurde
der Miniatur-Schlaufenreaktor etabliert. Für die Versorgung mit Primärmaterial war der
Aufbau einer Zellbank (CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut) erforderlich. In vorbereitenden
Untersuchungen wurden zwei stromale Zelllinien charakterisiert und die Zellernte der
hämatopoietischen Zellen durch enzymatische Lyse der Träger etabliert. Die Optimierung
verschiedener, für die immobilisierte Kokultur relevanter Parameter erfolgte im Miniatur-
Schlaufenreaktor, wobei die mononukleären Zellen (MNC) bis zu 454fach, die
koloniebildenden Zellen (CFC) bis zu 26fach und die Cobblestone-Area-Forming-Cells
(CAFC) bis zu l8fach expandiert wurden. Im immobilisierten System konnte selbst die
Population der SCm-Maus repopulierenden Zellen (SRC) erhalten werden, die im parallel
betriebenen Suspensionssystem nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Das zeigt, dass die
Kokultur in Bezug auf Unterstützung und Vermehrung der frühen Vorläuferzellen der
Suspensionskultur überlegen ist. Auf Basis der Optimierung im Miniatur-Schlaufenreaktor
konnten die hämatopoietischen Zellen auch im Festbettreaktor erfolgreich expandiert werden,
wobei die Kokultur mit der Stromazelllinie S1/Sl und den Standardzytokinen (IL-3, TPO, SCF
und FL) zu den besten Resultaten führte: So konnten die MNC maximal lO3fach, die CFU-
GM l14fach und die CAFC l5fach expandiert werden. Diese Expansionsdaten entsprechen
einem medizinischen Maßstab, wodurch die klinische Relevanz dieser Ergebnisse belegt ist.
The ex vivo expansion of hematopoietic cells is an important technique for many medical
applications. The cultivation concept in this study was the ex vivo simulation of the human
bone marrow by co-culture of hematopoietic and stromal cells in a fixed-bed bioreactor .
Thereby the cells are immobilized on macroporous collagen microcarriers. A miniaturized
loop-reactor was established for screening purposes. For the full supply with primary CD34+-
cells a cord blood bank was built up. In preliminary investigations two stromal cellines were
characterized and the harvest of immobilized cells established by enzymatic lysis of the
carriers. The relevant parameters for the co-culture were optimized in the miniaturized loop-
reactor. In this system the mononuclear cells (MNC) were expanded up to 454 fold, the
colony-forming-cells (CFC) up to 26 fold and the cobblestone-area-forming cells (CAFC) up
to 18 fold. In this system the SCm-mouse repopulating cells (SRC) were maintained in
contrast to a parallel cultivation in a suspension system. This demonstrates the positive effect
of the stromal based, immobilized culture compared to the suspension culture of this cells.
Based on the optimization in the screening system the hematopoietic cells were successfully
expanded in the fixed-bed bioreactor. The co-culture with the stromal cellline SVSl and the
cytokines IL-3, TPO, SCF and FL led to the best results. In this system the MNC were
expanded maximal 103 fold, the CFU-GM 114 fold and the CAFC 15 fold. These data
correspond the medical yardstick demonstrating the clinical relevance of the results presented
in this study.
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