Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3839
Fischer, Torsten
Oberflächen-Plasmon-Resonanz spektroskopische Studie an verschiedenen Biosensoroberflächen Charakterisierung von protein-Peptid und Protein-Lipid Wechselwirkungen
IX, 129 S., 2000
Die Oberflächen-Plasmon-Resonanz Spektroskopie (SPR-Spektroskopie) ist eine Technik zur
zeitaufgelösten Messung von Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen. Für die Messungen ist
es nötig, einen Bindungspartner auf der Oberfläche eines Sensorchips zu immobilisieren. Die
Messungen werden als Sensorgramme aufgezeichnet. In der vorliegenden Arbeit sind
unterschiedliche Oberflächen ausgetestet worden. Als biologisches Modellsystem für die
Untersuchung von Wechselwirkungen diente die Bindung von Calmodulin an ein synthetisches
Peptid, das der Aminosäuresequenz der CaM-Bindungsstelle aus der Stickoxidsynthase Typ I
entspricht. Für die Bindung von CaM an dieses Peptid NOS-I WT wurden die Ratenkonstanten (ka,
kd) und die Gleichgewichtskonstanten (KD) mit verschiedenen Auswerteverfahren bestimmt.
Die Dissoziationskonstanten, die aus den Sensorgrammen für die verschiedenen
Sensorchipoberflächen bestimmt wurden, nahmen mit steigender Immobilisierungsdichte zu. Eine
Analyse der aus den Sensorgrammen bestimmten Ratenkonstanten zeigte, daß mit zunehmender
Immobilisierungsdichte besonders ka stark abnahm. Die Sensorgramme auf den verschiedenen
Sensoroberflächen waren bei hoher Immobilisierungsdichte mit einem monoexponentiellen
Bindungsmodell nicht mehr zu erklären. Dies zeigte sich auch in der abnehmenden Stöchiometrie
von Peptid NOS-I WT zu CaM bei zunehmender Immobilisierungsdichte des Peptids. Die beste
Übereinstimmung mit den Literaturwerten wurde auf einer Dextranoberfläche bei sehr geringer
Immobilisierungsdichte (< 5.8 fmol/mm2) an Peptid (NOS-I WT) erreicht (KD-Werte von 0.8 -
3.9 nM).
Weiterhin wurden Sensorchips mit hydrophoben Oberflächen hergestellt, um
Heterodoppelschichten oder Phospholipiddoppelschichten aufzubauen. Diese Sensorchips wurden
eingesetzt, um die Ca2+-abhängige Membranassoziation des Ca2+-Bindungsproteins Recoverin zu
untersuchen. Eine N-terminale Myristoylgruppe verankert Recoverin bei hohen
Calciumkonzentrationen in der Membran. Es wurden Mutanten von Recoverin untersucht, deren Affinitäten
für Ca2+-Ionen im Vergleich zum Wildtyp verändert waren. Alle Recoverinformen (nativ,
rekombinant myristoyliert (WT), EF+4, EF-3, EF-2) zeigen eine Bindung an die hydrophobe
Sensorchipoberfläche in Gegenwart von Ca2+-Ionen, allerdings mit unterschiedlichen Affinitäten
(EC50: natives Recoverin = 18 µM; WT = 5 µM; EF+4 = 29 µM; EF-3 = 8 µM; EF-2 = 9 µM).
Intererssanterweise konnte auch eine Bindung an die Phospholipidschicht in der Abwesenheit von
Ca2+ detektiert werden, die aber mit deutlich geringerer Amplitude erfolgte.
Surface plasmon resonance spectroscopy (SPR spectroscopy) is a technique for the
time-resolved measurement of interactions between macromolecules. For these
measurements, it is necessary to immobilize a binding partner on the surface of a
sensor chip. The measurements are recorded as sensorgrams. In the present study,
different surfaces were tested. The biological model system for the investigation of
interactions was the binding of calmodulin to a synthetic peptide which corresponds
to the amino-acid sequence of the CaM binding site from the type-1 nitrogen oxide
synthase. For binding CaM to this peptide, NOS-I WT, the rate constants (ka, kd) and
the equilibrium constants (Kd) were determined by different evaluation methods.
The dissociation constants determined from the sensorgrams for the different sensor
chip surfaces increased with rising immobilization density. An analysis of the rate
constants determined from the sensorgrams showed that especially ka decreased
substantially with increasing immobilization density. The sensorgrams on the different
sensor surfaces could no longer be explained by a monoexponential bond model at
high immobilization density. This was also reflected in the decreasing stoichiometry
of peptide NOS-I WT for CaM at increasing immobilization density of the peptide. The
best agreement with the literature values achieved on a dextran surface at very low
immobilization density (< 5.8 fmol/mm2) on peptide NOS-I WT (KD values of 0.8 - 3.9
nM).
Furthermore, sensor chips with hydrophobic surfaces were produced to build up
heterobilayers or phospholipid bilayers. These sensor chips were used to investigate
the Ca2+-dependent membrane association of the Ca2+ binding protein recoverin. An
N-terminal myristoyl group anchors recoverin at high calcium concentrations in the
membrane. Mutants of recoverin were examined, whose affinities for Ca2+ ions were
modified in comparison to the wild type. All forms of recoverin (native, recombinantly
myristoylated (WT), EF+4, EF-3, EF-2) show a bond to the hydrophobic sensor chip
surface in the presence of Ca2+ ions, although with different affinities (EC50: native
recoverin = 18 µM; WT = 5 µM; EF+4 = 29 µM; EF-3 = 8 µM; EF-2 = 9 µM).
Interestingly enough, it was also possible to detect a bond to the phospholipid layer
in the absence of Ca2+ which, however, occurred with a markedly lower amplitude.
Neuerscheinungen
Schriften des Forschungszentrums Jülich
Ihre Ansprechperson
Heike Lexis
+49 2461 61-5367
zb-publikation@fz-juelich.de