Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3665
Kehren, Verena
Klonierung und Charakterisierung der Promotorregion eines Dopamin D1-Rezeptorgensaus Drosophila melamogaster
103 S., 1999
In dieser Arbeit wurde erstmals die Promotorregion eines biogenen Amin-Rezeptorgens aus
Evertebraten kloniert und charakterisiert. Die Analyse der 5'-RACE-Klone zeigte, daß das
erste Exon des DmDop1-Rezeptorgens im Vergleich zur bisher bekannten Sequenz um 125
Bp in 5'-Richtung länger ist. Durch eine Primer-Extension Analyse wurden zwei potentielle
Transkriptionsstartpunkte identifiziert. Ein Transkriptionsstart liegt im Bereich der längsten 5'
RACE-Klone, ein zweiter ist um 22 Basen in 3'-Richtung verschoben. Beide Startpunkte
liegen innerhalb eines INR-(Initiator-) Elements, das für ca. 50 % aller Drosophila-
Promotoren typisch ist. Innerhalb des sequenzierten ca. 2 kb großen Promotorbereichs sind
weder TATA- noch CAAT-Boxen vorhanden. Der Promotor enthält mehrere GC-reiche
Sequenzen, sowie potentielle Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, Zeste,
su(Hw) und DEP2.
Die regulatorischen Elemente des Promotors wurden durch CAT-Reportergenanalysen
eingegrenzt. Alle Promotorkonstrukte wurden transient in die neuronalen Zellinien SK.N.SH
und Neuro.2a sowie in die Nierenzellinie HEK293 transfiziert. Die höchsten CAT-Aktivitäten
wurden in den neuronalen Zellen gemessen. In der SK.N .SR Neuroblastom-Zellinie wurde
eine stark aktivierende Region im Bereich von ( -454/+ 125) sowie zwei Silencer-Regionen im
Bereich von (-1481/-454) und (+125/+495) identifiziert. Eine Bindung von SK.N.SH-
Kernproteinen an diese Sequenzen wurde mit Gelshift-Analysen nachgewiesen.
Der DmDop1-Promotor wird zelltypspezifisch exprimiert. Dies wurde mit in situ-
Hybridisierungen an Gewebeschnitten gezeigt. Transkripte wurden im ZNS, der Retina und in
den Antennen gefunden. In Larven und in adulten Tieren wurden Transkripte auch in den
Gonaden nachgewiesen.
In einem der Silencer-Elemente wurde eine CRE-Bindestelle identifiziert. Dieser Bereich
könnte einen Einfluß auf die gewebsspezifische Regulation des Rezeptorgens haben. Die
Aktivierung der Dopamin D1-Rezeptoren führt zu einer Stimulierung der Adenylatzyklase.
Dadurch wird die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöht. Transkriptionsfaktoren der
CREB/ATF1 Familie, die an die CRE-Bindestelle binden können, werden cAMP-abhängig
reguliert. Eine Autoregulation der Rezeptorgenexpression durch diese cAMP-abhängigen
Transkriptionfaktoren und ein damit verbundener selektiver Untergang von Nervenzellen
(Apoptose ), ist eine Möglichkeit, wie die Differenzierung des ZNS von Drosophila
melanogaster reguliert werden könnte.
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