Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3626
Während der biotechnologischen Produktion von Riboflavin kann es zu hyperosmotischem
Streß kommen, der die Riboflavinexkretion erniedrigt. Daher ist die Erforschung der
vorliegenden Adaptationsmechanismen von wirtschaftlichem Interesse. A. gossypii zeichnet
sich durch hohe Osmotoleranz, aber geringe Halotoleranz aus. Der Pilz adaptiert an
hyperosmotischen Streß durch die Akkumulation von Polyolen, hauptsächlich von Glyzerin.
Glyzerin wird über Biosynthese zur Verfügung gestellt, das Glyzerin-Aufnahmesystem wird
zum Schutz gegen Verluste durch funktionelle Umkehr des Carriers unter dem Druck des
auswärts gerichteten Glyzeringradienten in seiner Aktivität herunterreguliert.
During fed-batch fermentation processes as well as in its natural habitat, A. gossypii
frequently encounters hyperosmotic stress which leads to reduced riboflavin oversynthesis.
The osmoadaptation mechanisms of A. gossypii were investigated, hereby distinguishing
between halo- and osmotolerance by exposure to NaCl and mannitol stress. Growth and
ultrastructure of differently treated cells were compared and the intracellular contents of
compatibJe solutes and inorganic ions were quantified. Glycerol was found to be the
predominant compatible solute in Ashbya gossypii, accumulation of inorganic ions could not
be detected. Measurement of glycerol uptake under isosmotic conditions as weil as upon
hyperosmotic stress revealed the existence of a highly active glycerol uptake system, which
however was down-regulated under hyperosmotic stress. Investigation of glycerol
biosynthesis by measuring glycerol-3-phosphate-dehydrogenase activity under hyperosmotic
conditions indicated that accumulation of glycerol in A. gossypii is solely due to biosynthesis.
Riboflavin uptake and excretion at the plasma membrane could be characterized to
be mediated by two separate carrier systems. Hereby, highly active export opposes uptake
of very low activity, rendering re-uptake of excreted riboflavin negligible for netto-excretion.
Riboflavin production by A. gossypii starts in the late growth phase when septa are formed in
the hyphae and vacuoles become visible. Vacuoles begin to pool big amounts of riboflavin.
As the vacuolar compartmentation of metabolites in general plays a major role in the
regulation of metabolism in fungi, determination of riboflavin fiuxes across the tonoplast was
crucial for understanding riboflavin transport in A. gossypii. For this purpose, two different
approaches to prepare and characterise vacuoles from the filamentous fungus were
developed, i.e. the isolation of vacuoles from hyphal cells and the controlled permeabilisation
of the plasma membrane. Furthermore, a purification procedure for the vacuolar H+-ATPase
of A. gossypii was established to characterise its subunit composition, hydrolytic activity and
sensitivity against specific inhibitors. Using these cell biological tools, dependence of
vacuolar riboflavin accumulation on the activity of the V-ATPase could be proven. By
transport assays, dynamic compartmentation of riboflavin between cytosol and vacuole was
shown to be based on active, A TPase-dependent accumulation and an energy-independent
efflux mechanism. By inhibition of the V-ATPase with the specific inhibitor concanamycin A,
effective redirection of vacuolar riboflavin contents into the growth medium was achieved. In
order to construct new strains with impaired vacuolar riboflavin accumulation, the vacuolar
ATPase subunit A structural gene VMA1 of A. gossypii was cloned and disrupted. Cloning
was achieved by PCR using degenerated oligonucleotide primers derived form conserved
sequences of the Vma1 proteins from yeast and filamentous fungi. Disruption of the
Ag VMA 1 gene led to complete excretion of riboflavin into the medium instead of retention in
the vacuolar compartment, as observed under concanamycin A inhibition. Interestingly, in
cantrast to S. cerevisiae where disruption of the VMA 1 gene is conditionally lethai and to
N. crassa, where viable disruptants could not been isolated, disruption of the VMA 1 gene in
A. gassypii did not cause a lethai phenotype.
Förster, Carola
Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung des Riboflavintransports in Ashbya gossypii
131 S., 1999
Der filamentöse Pilz A. gossypii wird zur biotechnologischen Riboflavinproduktion eingesetzt.
Ziel dieser Arbeit war es, die vorliegenden Riboflavin-Transportprozesse und die
Adaptationsmechanismen an hyperosmotischen Streß zu charakterisieren und die
Ergebnisse zur Konstruktion von Mutanten mit verbesserter Riboflavinexkretion zu nutzen.
Die Riboflavinaufnahme über die Plasmamembran wurde als carrier-vermittelter
Transportprozess hoher Affinität aber niedriger Aktivität charakterisiert. Der Export wird über
ein separates Carrier-System vermittelt. Die Exportraten steigern sich im Verlaufe der
Produktion um ein Mehrfaches und betragen in der späten Produktionsphase etwa das
20fache der gemessenen Aufnahmeraten. Wiederaufnahme des sezernierten Riboflavins in
die Zelle ist im Vergleich zum Export für die Netto-Exkretion vernachlässigbar. Für die
Analyse der vakuolären Riboflavinspeicherung wurden zellbiologische Techniken entwickelt,
die Zugang zum vakuolären Kompartiment verschafften. Hierfür wurden Methoden zur
Isolierung der Organellen und zur Erstellung von Vakuolen in situ durch selektive
Permeabilisierung der Plasmamembran etabliert. Außerdem wurde eine Methode zur
Aufreinigung der vakuolären H+-ATPase entwickelt, um ihre Aktivität und Inhibitorsensitivität
zu charakterisieren. Über Kompartimentierungssudien und kinetische Analyse der
vorliegenden Riboflavinflüsse an der vakuolären Membran konnte ein dynamisches
Gleichgewicht von Riboflavin zwischen Cytosol und Vakuole nachgewiesen werden. Dieses
Gleichgewicht wird nach metabolischen Bedürfnissen durch aktive, ATPase-abhängige
Aufnahme und energieunabhängigen Efflux von Riboflavin reguliert. Unter Inhibiton der
V-ATPase mit dem spezifischen Inhibitor Concanamycin A konnte eine Umlenkung der
vakuolären Riboflavinflüsse ins Kulturmedium erreicht werden. Durch Erzeugen einer
V-ATPase-Defektmutante wurden neue Stämme mit dieser Eigenschaft erhalten. Die
Inaktivierung der V-ATPase erzeugte einen bisher bei Pilzen nicht beschriebenen Phänotyp,
der trotz dysfunktionaler Vakuole uneingeschränkt lebensfähig ist. Die VMA1-Disruptanten
weisen weiterhin signifikante Riboflavinflüsse nur über die Plasmamembran auf. Sie können
damit geeignet sein, den Plasmamembran-ständigen Riboflavinexporter zu isolieren, um ihn
zur weiteren Verbesserung der Produktion überzuexprimieren. Als Grundlage für einen
alternativen Ansatz, dessen Ziel die Umlenkung der Riboflavinflüsse durch Deletion des
vakuolären Riboflavinexporters ist, wurde als Screening-System die 2-dimensionale
Gelelektrophorese vakuolärer Membranproteine etabliert.
The filamentous fungus Ashbya gossypii is used for industrial riboflavin (vitamin B2
production. Biosynthesis, regulation and production parameters have been studied
thoroughly in the past, resulting in weil established fermentation processes with a reported
maximum yield of 15 g/l. The present work adresses now the still outstanding analysis of
riboflavin transport processes in A. gossypii. On the basis of this characterization, producing
strains with an improved riboflavin excretion were developed.
The new disruptant strains only show significant riboflavin transmembrane fiuxes via the
plasma membrane export carrier system. They could therefore be apt for screening on the
plasma membrane export carrier to achieve further improvement of riboflavin excretion in the
future. As an alternative strategy to impair vacuolar riboflavin accumulation, the 2-
dimensional separation of vacuolar membrane proteins via 2-D-gelelektrophoresis was
established as a screening method on the vacuolar riboflavin uptake protein via spot
matching analysis between strains which differ in their vacuolar riboflavin accumulation.
Neuerscheinungen
Schriften des Forschungszentrums Jülich
Ihre Ansprechperson
Heike Lexis
+49 2461 61-5367
zb-publikation@fz-juelich.de