Verlag des Forschungszentrums Jülich

JUEL-3606
Reuter, Uwe
Genetische und physiologische Untersuchungen zur Pantothenat- und Valinbildung in Corynebacterium glutamicum
115 S., 1998

Corynebacterium glutamicum wird seit vielen Jahren zur großtechnischen G ewinnung der Aminosäuren L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmals die Pantothenatbildung in C. glutamicum zu untersuchen und die Valin- und Pantothenatgewinnung zu steigern, um somit die Voraussetzungen für eine mikrobielle Produktion dieser beiden wirtschaftlich sehr interessanten Substanzen zu schaffen.

• Mit Hilfe von E. coli Mutanten wurden die Gene für die Enzyme der Pantothenatbiosynthese Ketopantoathydroxymethyltransferase (panB) und Pantothenatsynthetase (panC) aus C. glutamicum kloniert. Die Sequenzanalyse ergab, daß panB 813 bp und panC 837 bp umfaßt. Die Gene bilden ein Operon und enthalten sehr viele selten benutzte Codons, was für eine geringe Expression spricht.
• Tests für Enzyme der Pantothensäuresynthese wurden entwickelt. Die spezifische Aktivität der Pantothenatsynthetase beträgt 1 nmol/(min*mg Protein), die der Ketopantoathydroxymethyltransferase 0,14 nmol/(min*mg Protein) und die der Aspartat-a-decarboxylase 0,11 nmol/(min*mg Protein). Die Aktivitäten sind damit im Vergleich zu den Aktivitäten der Enzyme der Aminosäuresynthese außergewöhnlich gering.
• Die quantitative Analyse ergab, daß C. glutamicum 10 µg/1 Pantothenat akkumuliert. Es wurde ein System zur Selektion von Mutanten mit erhöhter Pantothenatbildung etabliert, das sich einen Ketobutyrat-bedingten Pantothenatmangel zunutze macht. Damit konnte eine Mutante isoliert werden, welche 250 µg/1 Pantothenat und 1 ,4 g/1 Valin akkumuliert.
• Durch die Überexpression der Valin- und Isoleucinsynthesegene ilvBNCD kombiniert mit der Deletion des Gens für die Threonindehydratase (ilvA) konnte ein Stamm konstruiert werden, der 11 ,3 g/1 Valin und 190 mg/1 Pantothenat akkumuliert. Bei zusätzlicher Überexpression der Pantothenatsynthesegene panBC wurde eine Pantothenatakkumulation von bis zu 1 g/1 erreicht. Dies bedeutet, daß die Pantothenatbildung in C. glutamicum um den Faktor 105 gesteigert werden konnte.

The Gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum is used for the production of amino acids, e.g. of L-glutamate and L-Iysine. The aim of my work was to elucidate the biosynthetic pathway of pantothenic acid of this organism, and to increase the formation of L-valine and D-pantothenic acid in order to enable a microbiological production of these compounds.
The genes panB and panC were cloned, which encode the ketopantoatehydroxy- methyltransferase and the pantothenatesynthetase. The two enzymes catalyze important steps of the biosynthetic pathway of pantothenate. Sequence analysis revealed that panB comprises 813 bp and panC 837 bp. The genes are organized as an operon. Assays for the enzymes of the pathway have been developed. The pantothenatesynthetase has a specific activity of 1 nmol/(min*mg protein), the ketopantoatehydroxymethyltransferase one of 0.14 nmol/(min*mg protein) and the aspartate-a-decarboxylase one of 0.11 nmol/(min*mg protein). The quantitative analysis of the formation of pantothenic acid revealed that C. glutamicum accumulates 10 µg/l pantothenic acid. A system to isolate mutants with an increased formation of pantothenate, which is based on a deficiency of pantothenic acid induced by [alpha]-ketobutyrate, has been established. The application of this method led to the isolation of a mutant which accumulates 250 µg/l pantothenate and 1.4 g/l valine. Overexpression of the genes of the valine and isoleucine biosynthetic pathway (ilvBNCD), in combination with the deletion of the threonine dehydratase gene ilvA resulted in the construction of a strain which accumulates 11,3 g/l valine and 190 mg/1 pantothenate. Additional overexpression of panBC led to an accumulation of up to 1 g/l pantothenic acid. Thus an increase of the formation of pantothenic acid in C. glutamicum by the factor of 10⁵ has been achieved.

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