Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3574
In dieser Arbeit wurde die Oligomerisierung des Na+/Ca2+-K+-Austauschers und seine
Assoziation mit dem cGMP-gesteuerten Kanal in ROS aus der Rinderretina untersucht. Dazu
wurde hauptsächlich die Methode der kovalenten Verbrückung benachbarter Proteine mit SH-
spezifischen Reagenzien verwendet. Vernetzte und unvernetzte Proteine wurden durch
denaturierende SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Western-Blots mit Antikörpern
gegen den Na+/Ca2+-K+-Austauscher und gegen die [alpha]- und [beta]-Untereinheit des cGMP-
gesteuerten Kanals analysiert.
In der Plasmamembran von ROS konnte der Na+/Ca2+-K+-Austauscher, durch katalytische
Oxidation benachbarter Thiole mit Cu2+-phenanthrolin, nahezu vollständig zu einem 490 kDa-
Crosslink verbrückt werden. Stabile Vernetzungsprodukte wurden ebenfalls mit dem SH-
spezifischen Reagenz N,N'-p-Phenyldimaleimid (PPDM) gebildet. Durch Neuraminidase-
behandlung wurde die apparente Molmasse des stark glykosylierten Na+/Ca2+-K+-
Austauschers um 50 kDa und die apparente Molmasse des 490 kDa-Crosslinks um 85 kDa
reduziert. D,L-l,4-Bismaleimido-2,3-butandiol (BMBD), ein neues SH-spezifisches und
spaltbares Vernetzungsreagenz, wurde verwendet, um gespaltene Vernetzungsprodukte in
einer zwei-dimensionalen SDS-Gelelektrophorese zu analysieren. Durch Reinigung des
BMBD-vernetzten Na+/Ca2+-K+-Austauschers und Analyse der gespaltenen Crosslinks
konnten Homodimere des Austauschers identifiziert werden. Höhere Oligomere wurden nicht
beobachtet, so daß der Na+/Ca2+-K+-Austauscher sehr wahrscheinlich als Homodimer in der
Plasmamembran vorliegt.
Vemetzungsprodukte des Austauschers wurden nach Solubilisierung in 10 mM CHAPS
nicht beobachtet. Der in Phosphatidylcholinvesikel rekonstituierte Austauscher konnte
dagegen zu einem geringen Prozentsatz wieder verbrückt werden. Dieses Ergebnis deutet
daraufhin, daß das Dimer des Na+/Ca2+-K+-Austauschers in Detergenz dissoziiert ist.
Die a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals kann mit SH-spezifischen Reagenzien nur
nach Aktivierung des Kanals mit cGMP verbrückt werden. abwohl der Na+/Ca2+-K+-
Austauscher kein cGMP bindet, zeigte er zusätzliche Vernetzungsprodukte mit apparenten
Molmassen von 330 kDa, 465 kDa und 545 kDa, wenn der Kanal vor der Verbrückung
aktiviert wurde. Diese Crosslinks des Austauschers banden, im Gegensatz zum monomeren
Austauscher und den Homodimeren, an eine Calmodulin (CaM)-Agarose-Säule. Da der
cGMP-gesteuerte Kanal nahezu das einzige CaM-bindende Protein in der Plasmamembran
von Stäbchenaußensegmenten ist, deutet die Bindung des vernetzten Austauschers an die
CaM-Säule aufeine kovalente Verbrückung mit dem Kanal hin. In einer zwei-dimensionalen
SDS-Gelelektrophorese der gespaltenen Vernetzungsprodukte wurden die a-Untereinheit des
cGMP-gesteuerten Kanals und der Na+/Ca2+-K+-Austauscher als Komponenten der 330 kDa-,
465 kDa- und 545 kDa-Crosslinks identifiziert.
Auf einer CaM-Agarosesäule wurde der größte Teil des Austauschers gebunden und mit
dem cGMP-gesteuerten Kanal ko-eluiert, wenn RaS-Membranen in 10 mM CHAPS
solubilisiert wurden. Der Austauscher band dagegen nicht an die Säule, wenn die Membranen
in 18 mM CHAPS solubilisiert wurden. Wurde der Austauscher affinitätschromatographisch
gereinigt und so der Kanal entfernt, konnte der Na+/Ca2+-K+-Austauscher ebenfalls nicht mehr
an eine CaM-Säule gebunden werden.
Der Austauscher band direkt an die a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals, wenn
Western Blots gereinigter Kanalproteine bzw. von RaS-Membranproteinen mit gereinigtem
Austauscher inkubiert wurden.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß der Na+/Ca2+-K+-Austauscher und
die [alpha]-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals in der Plasmamembran von
Stäbchenaußensegmenten assoziiert sind.
Alkylierung von SH-Gruppen des aktivierten und des nicht-aktivierten Kanals mit N-
Ethylmaleimid (NEM) und anschließende Verbrückung des aktivierten Kanals mit SH-
spezifischen Reagenzien deuten darauf hin, daß die a-Untereinheit des Kanals SH-Gruppen
besitzt, die im Protein geschützt sind und durch Aktivierung mit cGMP exponiert werden. Ein
-130 kDa-Crosslink wurde beobachtet, wenn SH-Gruppen der RaS-Membranproteine mit
NEM alkyliert wurden, bevor der Kanal aktiviert und vernetzt wurde. Dieser Crosslink ist sehr
wahrscheinlich auf ein Homodimer der a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals
zurückzuführen .
Auf der Grundlage der Dimerisierung des Na+/Ca2+-K+-Austauschers und der [alpha]-Untereinheit
und der Assoziation zwischen beiden Proteinen, wird ein Modell der ultrastrukturellen
Organisation des Komplexes aus caMP-gesteuertem Kanal und Na+/Ca2+-K+-Austauscher
vorgeschlagen.
In this study the oligomeric state ofthe Na+/Ca2+K+ exchanger and its association with the
cGMP-gated channel in bovine ROS were investigated, mainly using chemical cross-linking
techniques. Proteins were separated by SDS gel electrophoresis and analyzed on Western
Blots using antibodies against the Na+/Ca2+K+ exchanger and [alpha]- and [beta]-subunit ofthe cGMP-
gated channel.
In the native membrane, virtually all Na+/Ca2+K+ exchanger could be cross-linked mainly
to a 490 kDa product by catalysed disulfide formation with cupric-phenanthroline. Stable
crosslinks were also obtained with the thiol-specific reagent N,N'-p-phenylenedimaleimide.
Neuraminidase treatment of the heavily glycosylated exchanger and of the 490 kDa crosslink
reduced the apparent molecular mass by 50 kDa and 85 kDa, respectively. DL-1,4-
Bismaleimido-2,3-butanediol (BMBD), a novel SH-specific and cleavable crosslinker, was
used to analyse the cleaved crosslinks in two-dimensional SDS gel electrophoresis.
Purification of the BMBD cross-linked exchanger and analysis of the cleaved crosslinks
identified homodimers ofthe exchanger. Higher oligomers were not detected, suggesting that
the Na+/Ca2+K+ exchanger exists as a homodimer in the plasma membrane.
No crosslinks ofthe exchanger were obtained after solubilization in 10 mM CHAPS, but a
small percentage of the exchanger was cross-linked, when the exchanger was reconstituted
into phosphatidylcholine vesicles. This finding suggests that the exchanger dissociates into
monomers, when solubilized in detergent.
SH-specific reagents did not crosslink the a-subunit of the cGMP-gated channel, unless it
was activated by cGMP. Although the Na+/Ca2+K+ exchanger did not bind cGMP, it showed
additional crosslinks with apparent molecular masses of 330 kDa, 465 kDa and 545 kDa,
when the channel was activated before crosslinking. These crosslinks of the exchanger were
bound to a calmodulin (CaM)-agarose column, whereas the monomeric exchanger and its
homodimers did not bind to CaM-agarose. Since the cGMP-gated channel is the major CaM-
binding protein in the plasma membrane of the ROS, binding of the cross-linked exchanger
suggests that it was covalently bound to the channel. Two-dimensional SDS gel
electrophoresis of the cleaved crosslinks identified the [alpha]-subunit of the cGMP-gated channel
and the Na+/Ca2+K+ exchanger as components of the 330 kDa, 465 kDa and 545 kDa cross-
links.
On a CaM-agarose column, most of the exchanger was bound and co-eluted with the
cGMP-gated channel, if ROS-membranes were solubilized in 10 mM CHAPS, but not if
solubilized in 18 mM CHAPS. On the other hand, exchanger did not bind to CaM-agarose,
when channel protein was removed by affinity purification.
Na+/Ca2+K+ exchanger bound directly to the [alpha]-subunit of the cGMP-gated channel if
Western Blots of purified channel proteins and total ROS membrane proteins were incubated
with purified exchanger protein.
Together, these findings suggest that the Na+/Ca2+K+ exchanger and the [alpha]-subunit ofthe
cGMP-gated channel are associated in the plasma membrane ofrod outer segments.
Alkylation of SH-groups of the activated and non-activated channel with N-
ethylmaleimide (NEM) and subsequent treatment of the activated channel with SH-specific
reagents suggests that the [alpha]-subunit contains thiol-groups that were buried within the protein
and exposed by activation with cGMP .A -130 kDa crosslink product of the [alpha]-subunit was
detected when thiol-groups of ROS membrane proteins were alkylated with NEM before the
channel was activated and cross-linked. This crosslink is apparently due to a homodimer of
the [alpha]-subunit ofthe cGMP-gated channel.
On the basis ofthe dimerization ofthe Na+/Ca2+K+ exchanger and the [alpha]-subunit and the
association between both proteins, a model of the ultrastructural organization of the complex
of cGMP-gated channel channel and Na+/Ca2+K+ exchanger is proposed.
Schwarzer, Andreas
Charakterisierung des Komplexes aus Na+/Ca2+ -K+ - Austauscher und cGMP gesteuertem kanal in der Plasmamembran von Stäbchenaussensegmente - biochemische Untersuchungen zur Ultrastruktur Ca2+ - transportierender Proteine in Photorezeptoren von Vertebraten
100 S., 1998
In Photorezeptoren von Vertebraten spielt die intrazelluläre Ca2+-Konzentration eine
entscheidende Rolle für die Signaltransduktion und Lichtadaptation. Die Ca2+-Konzentration
im Außensegment von Rindersehstäbchen wird durch einen Ca2+-Einstrom durch cGMP-
gesteuerte Kanäle und einen auswärtsgerichteten Ca2+-Transport durch Na+/Ca2+-K+-
Austauscher bestimmt. Beide Proteine sind in der Plasmamembran der
Stäbchenaußensegmente (ROS) lokalisiert.
In vertebrate photoreceptors, the intracellular Ca2+ concentration plays a crucial role for signal
transduction and light adaptation. In bovine rod outer segments (ROS) intracellular Ca2+
concentration is set by Ca2+ influx through cGMP-gated channels and extrusion of Ca2+ ions
by Na+/Ca2+K+ exchangers. Both proteins are localized in the plasma membrane ofthe outer
segment.
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