Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3418
Schörken, Ulrich
Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Transketolase und Transaldolase, sowie biochemische Charakterisierung der Enzyme aus Escherichia coli
117 S., 1997
Transketolase und Transaldolase sind Enzyme aus dem nichtoxidativen Zweig des Pentosephosphatweges und
katalysieren den reversiblen Transfer von C2- bzw .C3-einheiten zwischen verschiedenen Zuckerphosphaten.
Die Transketolase wurde mit Hilfe von (NH4)2SO4-Fällungen und Anionenaustauschernmit einer Ausbeute von 45 % bis zur Homogenität gereinigt. Die KM-Werte für ThDP variieren in Abhängigkeit der Kationenkonzentration zwischen 1 und 29 µM. Die spezifische Aktivität von Transketolase beträgt 110 U/mg. Das Enzym besitzt ein breites Substratspektrum, es konnten auch unphysiologische Substrate, wie Desoxy-, Nitro- und Azidozucker, mit Aktivitäten zwischen 3 - 18 U/mg umgesetzt werden. Von der Transketolase wurden sowohl Kristalle vom Apo- wie auch vom Holoenzym erhalten, womit native Datensätze bis zu einer Auflösung von 2.0 Å gemessen und ausgewertet werden konnten. Anhand der bekannten Struktur der Transketolase aus S.cerevisiae wurden Untersuchungen am Substratkanal der Transketolase durchgeführt. Arg359, Ser386 und Arg 521 sind an der Bindung der Phosphatgruppe der physiologischen Substrate beteiligt. Asp470 zeigt Wechselwirkungen mit der C2- Hydroxylgruppe der Akzeptorsubstrate. Enzymvarianten mit ortsspezifischen Veränderungen des Restes Asp470 ermöglichten Umsetzungen mit pyridincarbaldehyden. Eine His 103-Transketolase-Variante setzte erstmals pyruvat als Donorsubstrat unter Bildung von 1-Desoxyketosen um.
Die Transaldolase wurde mit Hilfe von (NH4)2SO4-Fällungen und Anionenaustauschern mit einer Ausbeute von 50
% bis zur Homogenität gereinigt. Hohe Umsatzgeschwindigkeiten wurden bei der Transaldolase nur mit den
physiologischen Substraten erreicht (Vmax = 80 U/mg), wogegen die maximale Aktivität mit unphosphorylierten
Substraten 8 U/mg betrug. Durch KBH4-Reduktion wurde ein stabiler Enzym-Substrat-Komplex der Transaldolase
synthetisiert. Die 3D-Struktur von der nativen Transaldolase, sowie des Enzym-Substrat-Komplexes, wurde in
Zusammenarbeit mit Prof. Schneider, Stockholm, gelöst. Die Transaldolase besitzt wie die verwandten Klasse-I-
Aldolasen eine a/ß-Barrel-Struktur. Ortsgerichtete Mutagenesen wurden im aktiven Zentrum (Asp17, Asn35,
Ser176) und im Dimerisierungs-bereich (Arg300) der Transaldolase durchgeführt. Die Austausche von Asp 17 und
Asn35 führten zu Aktivitäts-verlusten von > 98 %. Eine Veränderung von Serl76 resultierte in einem fünffach
erhöhten KM-Wert der Enzymvariante für das Donorsubstrat. Durch einen Austausch von Arg300 lag das Enzym bei
pH 8.5 als Monomer vor, wobei die Aktivität und Stabilität nur geringfügig erniedrigt war.
Transketolase aqnd Transaldolase are enzymes ofthe non-oxidative pentosephosphate pathway and catalyze the
reversible transfer of C2- and C3-fragments between different sugarphosphates.
Transketolase was purified by fractionated ammonia sulfate precipitations and anion exchange columns to homogeneity with a yield of 45%. The specific activity oftransketolase was 110 U/mg. Besides the physiological sugarphosphates also unphosphorylated sugar derivates as deoxy-, nitro and acidosugars were accepted with rates up to 18 U/mg.Crystals from apo- and holotransketolase were obtained and X-ray datasets were measured to a resolution of 2.0 angström. With the knowledge ofthe transketolase structure from yeast investigations in the E.coli transketolase substrate channel were performed. Arg359, Ser386 and Arg521 are involved in binding the phosphate group ofthe substrate. Asp470 is neccessary for binding the C2-hydroxyl group ofthe acceptor sugars. Site specific mutations at position Asp4 70 lead to mutants that accepted pyridinecarbaldehyds. With a His 103 yeast transketolase mutant for the ftrst time pyruvate was a donor substrate for transketolase.
Transaldolase was purified purified by fractionated arnmonia sulfate precipitations and anion exchange columns to
homogeneity with a yield of 50%. High conversion rates were obtained for transaldolase only with the physiological
substrates (80 U/mg), with unphosphorylated substrates rates of 8 U/mg were the maximum. With KBH4-reduction a
stable enzyme-substrate-complex oftransaldolase could be synthesized. The 3D-structure ofnative transaldolase and
the complex was solved in cooperation with the group ofProf. Schneider, Stockholm. Transaldolase has as the
related aldolases an alpha/beta barrel structure. From the X-ray structure site directed mutagenesis ofthe actice
centre (Asp17, Asn35, Ser176) and the dimerisation area (Arg300) were performed. Exchanges of Asp17 and Asn35
resulted in an almost complete loss ofactivity. A change ofresidue Ser176 lead to a five fold decrease in the affmity
towards the donor substrate. An exchange of Arg300 lead to a monomeric enzyme at pH 8.5, however, the activity
and the stability ofthe transaldolase are unaffected.
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