Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4270
Cukkemane, Abhishek
Structural and functional studies of a prokaryotic cyclic nucleotide-gated channel
VIII, 114 S., 2008
Zyklisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle in kardialer und
neuronaler Erregbarkeit sowie in der Signaltransduktion primärer Sinneszellen. Die direkte
Bindung zyklischer Nukleotide aktiviert die Kanäle und führt zu einer erhöhten
Membranleitfähigkeit der Zelle. Obwohl viel über die Funktion dieser Ionenkanäle bekannt
ist, sind die molekularen Ereignisse, die von der Ligandenbindung zur Kanalöffnung führen,
weitgehend unbekannt.
Ich habe mich in meiner Arbeit mit der Ligandenbindung prokaryotischer zyklisch Nukleotidgesteuerter
Ionenkanäle beschäftigt. Einer dieser Ionenkanäle, der zyklisch Nukleotidgesteuerte
Ionenkanal des stickstofffixierenden Bakteriums Mesorhizobium loti (mlCNG),
eignete sich besonders gut für biophysikalische Untersuchungen. Eine der
Hauptfragestellungen, an denen ich arbeitete, war, in welcher Weise sich das Schaltverhalten
des Ionenkanals auf die Ligandenbindung auswirkt. Ich habe Bindungsstudien sowohl an dem
tetrameren mlCNG-Kanal als auch an der isolierten ligandenbindenden Domäne (CNBD)
durchgeführt. Die Affinität der zyklischen Nukleotide zum mlCNG-Kanal sowie zur CNBD
wurde mit spektroskopischen Methoden bestimmt. Beide Proteine, der tetramere Ionenkanal
und die isolierte CNBD binden cAMP nicht-kooperativ mit sehr ähnlicher Affinität. Diese
Ergebnisse deuten an, dass entweder nur ein sehr geringer Teil der Bindungsenergie für die
Aktivierung benötigt wird, oder aber, dass die Konformationsänderungen, die innerhalb der
CNBD stattfinden, schon den eigentlichen Aktivierungsschritt des Ionenkanals darstellen.
Ich habe Kristallographieansätze für den mlCNG-Kanal durchgeführt. Ich konnte
zweidimensionale Proteinkristalle züchten, die in einem quadratischen Gitter angeordnet
waren. Die Proteine zeigten eine tetramere Symmetrie und waren antiparallel angeordnet. Der
Kristall beugte zu etwa 15 Å. Dies ist eine gute Ausgangsposition für weitere Arbeiten, um
schließlich die Struktur des Ionenkanals in atomarer Auflösung zu erhalten.
Ion channels gated by cyclic nucleotides have crucial roles in cardiac and neuronal
excitability and in signal transduction of sensory neurons. On binding cyclic nucleotides these
channels are activated, which results an increase in membrane conductance. Although a lot of
information is available on the function of these channel proteins, the molecular events that
relay ligand binding to channel activation is not well understood.
Here, I studied ligand binding of prokaryotic cyclic nucleotide-activated K+ channels. One of
them, the mlCNG channel from the nitrogen-fixing bacterium Mesorhizobium loti was
suitable for biophysical characterization. One of the key questions that I worked on was how
gating of the channel affects its ligand binding properties? I performed ligand binding studies
on the tetrameric mlCNG protein and its isolated cyclic nucleotide-binding domain (CNBD).
Affinity of cyclic nucleotides to the full-length mlCNG protein and to the CNBD was
determined using spectroscopic methods. Both, the mlCNG channel and the CNBD bind
cAMP in a non-cooperative manner with similar binding affinity. These results indicate that
either no appreciable binding energy is required for activation, or the conformational change
in the CNBD is the activation step itself.
Crystallography experiments were performed on the mlCNG channel. Two-dimensional
crystals were obtained in which the channel proteins were ordered in a square lattice. The
channel proteins were assembled as tetramers and were arranged in a head-to tail fashion.
The crystal diffracts to 15 Å. This is an excellent starting condition for future work to
eventually obtain a structure at atomic resolution.
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