Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-4265
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich die Gram-positiven Bakterien Bacilus megaterium
und Corynebacterium glutamicum für die reduktive Ganzzellbiotransformation
eignen. Zur Charakterisierung der rekombinanten Stämme wurde die Umsetzung
von D-Fruktose zu D-Mannitol und Methylacetoacetat (MAA) zu (R)-Methyl-3-hydroxybutanoat
(MHB) untersucht. Für die Regenerierung des Kofaktors NADH wurde die Formiatdehydrogenase
genutzt. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Langzeitstabilität der Biokatalysatoren, die durch quantitative Analyse der intrazellulären NAD(H)-
Konzentration während der Biotransformation beurteilt wurde. Die für die Gram-positiven
Organismen erhoffte gute Kofaktorretention bestätigte sich. Beide untersuchten Spezies
zeigten über einen Zeitraum von bis zu 3 Tagen stabile Produktivitäten und unterschieden
sich damit signifikant von der E. coli-Ganzzellbiotransformation, die innerhalb
von 8 Stunden einen 80-90%-igen Abfall der spezifischen Produktivität zeigte.
Für die Umsetzung von D-Fruktose zu D-Mannitol sollte zudem der Zuckertransport
bei C. glutamicum näher charakterisiert werden. Dieser erwies sich als limitierend für
die Biotransformation. Durch Überexpression des Glukose/Fruktose Facilitatorgens aus
Zymomonas mobilis konnte die Produktivität von C. glutamicum um das 5,5-fache gesteigert
werden (Endkonzentration 470 mM D-Mannitol nach 24 Stunden). Mit Hilfe von
genomweiten Homologievergleichen konnten zwei Proteine (CGL0181 und CGL3058)
von C. glutamicum identifiziert werden, die eine hohe Strukturähnlichkeit zu GLF besaßen. Überexpressions- und Deletionsexperimente zeigten, dass diese Transporter D-Fruktose
in nicht phophorylierter Form in das Zytoplasma transportieren können, was
für C. glutamicum bisher noch nicht gezeigt wurde. Mit Hilfe dieser Transporter konnte
die D-Mannitol Produktivität von C. glutamicum verdoppelt werden und C. glutamicum
erwies sich neben B. megaterium als stabiler Mikroorganismus bei der Biotransformation.
Die Umsetzung von MAA zu MHB mit C. glutamicum und B. megaterium verlief deutlich
langsamer und erzielte innerhalb von 24 Stunden niedrige Endkonzentrationen (5-10
mM, 10% Umsatz). Durch Erhöhung des Lösungsmittelanteils bei Biotransformationen
mit substratgekoppelter Kofaktorregenerierung konnte eine Substratumsatz zwischen
50-80% erreicht werden. Beide Spezies zeigten eine hohe Lösungsmittel-Toleranz, was
ein Ansatzpunkt für weiterführende Arbeiten mit Lösungsmittel-abhängigen Biotransformationssystemen
ist.
The present work studied whether the Gram-positive bacteria Bacilus megaterium and
Corynebacterium glutamicum were suitable for reductive whole-cell biotransformations.
The conversion of D-fructose to D-mannitol and methyl acetoacetate (MAA) to (R)-
methyl-3-hydroxybutanoate (MHB) was investigated in order to characterize the recombinant
strains . Formate dehydrogenase was used to regenerate the cofactor NADH.
The investigation focused on the long-term stability of the biocatalysts, which was evaluated
by a quantitative analysis of the intracellular NAD(H) concentration during the
biotransformation . The good cofactor retention expected for the Gram-positive organisms
was confirmed. Both of the species studied displayed stable productivity over
a period of up to three days and thus differed significantly from the E. coli whole-cell
biotransformation, which showed an 80-90 % drop in specific productivity within 8 hours.
Furthermore, the sugar transport in C. glutamicum was to be characterized in more
detail for the conversion of D-fructose to D-mannitol, which had proved limiting for the
biotransformation . By overexpressing the glucose/fructose facilitator gene from Zymomonas
mobilis it was possible to increase the productivity of C. glutamicum 5.5-fold
(final concentration 470 mM of D-mannitol after 24 hours) . Genome-wide homology
comparisons were used to identify two proteins (CGL0181 and CGL3058) of C. glutamicum,
which had great structural similarity to GLF. Overexpression and deletion experiments
showed that these transporters can transport D-fructose into the cytoplasm in a
non-phosphorylated form, which had not previously been shown for C. glutamicum. The
D-mannitol productivity of C. glutamicum was doubled with the aid of these transporters
and, in addition to B. megaterium, C. glutamicum proved to be a stable microorganism
for the biotransformation.
With C. glutamicum and B. megaterium, the conversion of MAA to MHB proceeded significantly
more slowly and within 24 hours yielded low final concentrations (5-10 mM,
10 % conversion) . A substrate turnover of 50-80 % was achieved by increasing the solvent
fraction for biotransformations with substrate-coupled cofactor regeneration . Both
species displayed a high solvent tolerance, which provides a starting point for more
extensive work with solvent-dependent biotransformation systems.
Bäumchen, Carsten
Reduktive Ganzzellbiotransformation zur Gewinnung chiraler Alkohole mit Baillus megaterium und Corynebacterium glutamicum
VII, 91 S., 2008
Zusammenfassung
Abstract
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