Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3933
Gerigk, Marc
Integrierte Prozessentwicklung zur Herstellung von L - Phenylalanin mit Escherichia coli
III, 245 S., 2001
Diese Arbeit fasst die integrierte Prozessentwicklung zur fermentativen Produktion von
L-Phenylalanin mit Escherichia coli zusammen. Der Begriff "integriert" bezeichnet dabei die parallele,
sich gegenseitig beeinflussende, Entwicklung eines Fermentationsprozesses und die Identifikation
eines geeigneten, genetisch veränderten Produktionsstammes. Zudem beschreibt diese Arbeit die
Integration einer zeitgleich am Institut etablierten Methode zur Aufreinigung der Aminosäure mittels
Reaktiv-Extraktion. Zur Charakterisierung der L-Tyrosinauxotrophen, potentiellen
L-Phenylalaninproduzenten wurde ein hierfür universell einsetzbarer Fermentationsprozess entwickelt.
Dieser zeichnet sich insbesondere durch eine Regelung der Glucose- und L-Tyrosinzufuhr aus. Um
eine optimale Produktion zu gewährleisten, erwies sich eine limitierte Zugabe der essentiellen
Aminosäure während der Wachstumsphase und ein Glucoseüberschuss von 5g/l über den
Fermentationszeitraum als optimal.
Dieser Prozess war reproduzierbar und in den halbtechnischen Maßstab scale-up fähig. Der Einsatz
der geregelten L-Tyrosinzufuhr ermöglichte die Verwendung der für L-Tyrosin feedback-sensitiven
DAHP-Synthase (aroF). Durch die Überexpression dieses nativen Enzyms und der Identifikation
sowie Eliminierung reaktionslimitierender Schritte innerhalb der Aromatenbiosynthese wurde die L-Phenylalaninproduktion signifikant gesteigert. Zum Ende der Stammentwicklung konnten bei
geschlossener Kohlenstoffbilanz keine Intermediate der Aminosäuresynthese mehr nachgewiesen
werden.
Im Verlauf der Stamm- und Prozessentwicklung wurde die Fermentationsdauer, zur Bildung von über
30g/l L-Phenylalanin, von 50h auf 25h halbiert. Die integrale Produktselektivität wurde von 16,2% auf
24,4% und die integrale Raum-Zeit-Ausbeute von 0,8g/(1*h) auf 1,2g/(1*h) gesteigert.
Nach einem Scale-up des etablierten Fermentationsprozesses (300L) wurde durch die Integration des
Aufarbeitungsverfahrens L-Phenylalanin simultan abgetrennt und auf über 98% aufgereinigt. Durch
die Verringerung der L-Phenylalaninakkumulation konnte die integrale Produktselektivität von 15%
auf über 20% gesteigert werden. Mit der Rückführung des Fermentationsüberstands in den Bioreaktor,
wurde in dieser Arbeit ein so genannter Hybridprozess geschaffen und dessen Funktionsfähigkeit
erstmals im Pilotmaßstab gezeigt.
This work gives a summary of an integrated process development for the production of
L-phenylalanine by Escherichia coli. Hereby, the term "integrated" describes the simultaneous
development of the process and of different genetically engineered strains. Furthermore, this work
summarises the results obtained by the integration of a reactive-extraction DSP unit into the
fermentation process. An universal fermentation strategy was developed in order to characterise
potential auxotroph production strains of L-tyrosine. Two closed loop control strategies for glucose
(main carbon source) and L-tyrosine were introduced. To obtain optimal amino acid production,
L-tyrosine accumulation had to be prevented by limited feeding. Nevertheless, optimal growth should be
achieved. Furthermore, an glucose excess of 5g/l was found to be positive for high production rates.
This process was reproducible and a scale-up to pilot scale was successful. The L-tyrosine feed control
permitted the use of feed-back sensitive DAHP-synthase (aroF). Overexpressing the native enzyme
and further identification and elimination of bottlenecks within the aromatic amino acid pathway lead
to a significant increase in L-phenylalanine production. Fermentation of the final production strain
resulted in the prevention of aromatic amino acid intermediates accumulation.
Genetic engineering as well as process development lead to increasing production rates. Therefore,
the fermentation time to reach more then 30g/l L-phenylalanine was reduced from 50h to 25h. The
integral product yield increased from 16.2% to 24.4% and the integral space time yield from 0.8g/(1*)
to 1.2g/(1*h).
The down stream operation unit was successfully integrated after scale-up to the pilot scale (300L
bioreactor). L-phenylalanine was extracted simultaneously from the fermentation process and
concentrated up to over 98% using only one purification step. Furthermore, the decreasing amino acid
concentration during the fermentation lead to an increase in product yield from 15% to more than
20%. By recirculating the fermentation medium back into the bioreactor, a so-called hybrid process
was established which proved its function for the first time in pilot scale.
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