Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3971
In dieser Arbeit erfolgt die Stoffwechselquantifizierung über eine dynamische Methode bei
welcher der Mikroorganismus in einem definierten Fließgleichgewichtszustand kultiviert
wird, um dann schlagartig aus dieser Gleichgewichtslage ausgelenkt zu werden
("Pulsexperiment"). Über eine schnelle Probenahme und anschließende Analyse der
intrazellulären Metabolitkonzentrationen wird die Antwort des Stoffwechsels auf diese
Veränderung quantifiziert.
Unter Verwendung eines neuartigen Pulsaufgabesystems und in Kombination mit einer in
früheren Arbeiten entwickelten schnellen Probenahme wurden verschiedene dynamische
Pulsexperimente durchgeführt. Die Quantifizierung der dynamischen intrazellulären
Metabolitkonzentrationen erfolgte über neu entwickelte Analytik-Methoden aus dem Bereich
der HPLC-MS, UV-HPLC, CE und der enzymatischen Assays.
Im Bereich der Glucose- Verstoffwechselung fanden Untersuchungen an der
Substrataufnahme durch das PEP:PTS sowie der weiteren Verwertung in Escherichia coli
K12 statt. Anhand eines gentechnisch veränderten Stammes wurden diese Untersuchungen
erweitert. An einem PTS-defizientem Stamm (E. coli 3pMK7) wurde die veränderte
Stoffwechselsituation bei einer Umstellung der Abhängigkeit der Substrataufnahme von PEP
auf ATP analysiert. Ebenso wurde an E. coli K12 die Verstoffwechselung von Glycerol
untersucht. Es konnte mitunter eine starke Abhängigkeit der Glycerolaufnahme von der
intrazellulären ATP Konzentration nachgewiesen werden. In einem Experiment zur
Substratumstellung von Glycerol auf Glucose konnte die starke Abhängigkeit der
Glucoseaufnahme von der verfügbaren PEP Konzentration bestätigt werden.
Die zeitlichen Verläufe der intrazellulären Metabolitkonzentrationen aus solchen
Experimenten bilden die Grundlage für die Entwicklung kinetischer (strukturierter)
Stoffwechselmodelle. Durch die Modellierung der erhaltenen Daten konnten zahlreiche
Stoffwechselphänomene, welche zuvor nur phänomenologisch erklärt wurden, im Rahmen
strukturierter Modelle quantifiziert werden.
In this work a dynamic method is used for the quantification of microbial metabolism. The
microorganism is cultivated in a substrate limited steady state and then rapidly shifted away
from this metabolic equilibrium by application of a substrate pulse ("pulse experiment").
SampIes are taken using a rapid sampling and quenching technique, which was developed in
earlier works. The metabolites are then extracted and analyzed to determine the metabolic
response of the microorganism.
Using a novel system for injecting substrate pulses, a number of dynamic pulse experiments
were performed. Intracellular metabolite dynamics were quantified using newly developed
analytical techniques based on HPLC-MS, UV-HPLC, CE and enzymatic assays.
Pulse experiments were carried out to investigate the glucose uptake and utilisation via the
PEP:PTS in Escherichia coli K12. The scope of these investigations was expanded using a
genetically modified, PTS-deficient strain E. coli 3pMK7 in order to determine the metabolic
changes taking place when the substrate uptake depends on A TP instead of PEP. Additionally,
the utilisation ofglycerol by E. coli K12 and the dependency ofglycerol uptake on ATP was
investigated. In a further experiment, the switch from glycerol to glucose as carbon source
during a pulse experiment showed a strong limitation of the available PEP concentration
during uptake.
The time courses of intracellular metabolite concentrations from these pulse experiments are
the basis for the development ofkinetic (structured) metabolic models. The modelling ofthe
experimental data allowed a quantification of metabolic phenomena which up until now could
only be explained phenomenologically.
Buchholz, Arne K.
Quantifizierung intrazellulärer Metabolitdynamiken zur Untersuchung mikrobieller Stoffwechselnetzwerke
IV, 198 S., 2002
In der modernen Biotechnologie kann die gezielte, rationale Steigerung der Produktivität
zellulärer Systeme grob in zwei Teilbereiche eingeteilt werden. Zum einen besteht die
Möglichkeit über eine Optimierung der biotechnischen Prozeßführung ("bioprocess
engineering") eine Steigerung der Produktivität zu erreichen. Eine weitere Möglichkeit bildet
die gezielte Verbesserung des verwendeten zellulären Systems über gentechnische Eingriffe
in dessen Stoffwechsel ("metabolic engineering").
Die Entwicklung der molekularbiologischen Techniken eröffnet heutzutage die Möglichkeit,
gezielt in den Stoffwechsel der Produktionsorganismen einzugreifen und gestattet somit eine
rationale Entwicklung von Produktionsstämmen. Voraussetzung ist jedoch eine quantitative
Beschreibung der Dynamik und Regulation von Stoffflüssen in den mikrobiellen
Stoffwechselnetzwerken.
The rational improvement of the productivity of cellular systems is one of the main goals of
modem biotechnology and may be accomplished in two ways. One approach is the
optimization of the production process ("bioprocess engineering"). Another possibility is the
improvement of the cellular system itself by manipulating the metabolic pathways
("metabolic engineering").
A precise manipulation of microbial metabolism, and thereby a rational strain development, is
possible today by using the tools of molecular biology. However, a prerequisite of this
manipulation is a detailed and quantitative knowledge of the dynamics and regulation of
metabolic fluxes in microbial metabolism.
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