Verlag des Forschungszentrums Jülich
JUEL-3851
Die isolierte Kinase-Domäne besaß konstitutive Autokinase-Aktivität und übertrug die [gamma]-
Phosphatgruppe von ATP auf den "Response"-Regulator CitB. Ristidin-350 und Aspartat-56
konnten als wahrscheinliche Phosphorylierungsstellen von CitA bzw. CitB identifiziert
werden. In Anwesenheit von ATP bildete CitB-D56N einen stabilen Komplex mit der Kinase-
Domäne, der möglicherweise auch Chancen für eine Strukturaufklärung bietet.
Die periplasmatische Domäne war in der Lage, Citrat zu binden, jedoch keines der anderen
getesteten Tri- und Dicarboxylate. Die Enthalpie-getriebene Bindung erfolgte mit einer
Stöchiometrie von 1 und einem KD von 6 µM in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und
bei 25°C. Die pR-Abhängigkeit der Bindung mit einer maximalen Affinität bei pH 5,7 wies
darauf hin, daß R-Citrat2- gebunden wird. Der Mg-Citrat-Komplex wird wahrscheinlich nicht
gebunden, da Mg2+-Ionen die Citrat-Bindung inhibierten.
CitA aus K. pneumoniae ist der Prototyp einer Familie von Sensor-Kinasen, deren
Aminosäuresequenzen nicht nur in der C-terminalen Kinase-Domäne konserviert sind,
sondern auch in der periplasmatischen Domäne und der "Linker"-Domäne. In der
vorliegenden Arbeit wurden noch zwei weitere Mitglieder dieser Familie untersucht, nämlich
CitA und DcuS aus Escherichia coli.
Wie das K. pneumoniae CiWCitB-System reguliert auch das E. coli CiWCitB-System die
Expression von Citratfermentations-Genen. Bindungsstudien mittels isothermaler Titrations-
kalorimetrie zeigten, daß auch die periplasmatische Domäne der Sensor-Kinase CitA von
E. coli als Citrat-Rezeptor fungiert. Die Bindung erfolgte Enthalpie-getrieben mit einem KD
von 0,3 - 0,4 µM in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,0. Ein Austausch des Glycin-Restes
an Position 102 verhinderte die Citrat-Bindung.
Das DcuS/DcuR-System von E. coli reguliert die Expression von Genen der Fumarat-
Atmung. Eine Bindung von Fumarat oder Succinat an die periplasmatische Domäne der
Sensor-Kinase DcuS konnte jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Ursache dafür
ist wahrscheinlich der hohe KD-Wert, der basierend auf physiologischen Untersuchungen im
Bereich von 3-10 mM liegt.
Kaspar, Sibylle
Charakterisierung der Sensor-Kineasen CitA aus Klelsiella pneumoniae und Escherichia coli als Citrat-Rezeptoren
VII, 119 S., 2001
Das Zweikomponenten-Regulationssystem CiWCitB aus dem Enterobakterium Klebsiella
pneumoniae reguliert die Expression der Citratfermentations-Gene. In dieser Arbeit wurden
zwei Domänen der Sensor-Kinase CitA biochemisch charakterisiert, nämlich die C-terminale
Kinase-Domäne und die periplasmatische Domäne.
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